Redox. Biol.|巨噬细胞p300介导的p65Lys310乙酰化揭示小檗碱抗炎新机制

大家好，今天分享的文献是发表在 Redox Biology 的 Acetylation of p65 ^Lys310 by p300 in macrophages mediates anti-inflammatory property of berberine 。该研究通过 乙酰化修饰组学 探索了 小檗碱 抗炎 的的分子机制，发现 小檗碱通过抑制 p65 ^Lys310 乙酰化调节炎症因子表达 。

研究背景：

小檗碱 (Berberine, BBR) 是一种从黄连根茎中分离出来的以异喹啉为结构基础的生物碱，其显著特征是通过 核因子κ B (NF-κB) 信号通路发挥其抗炎活性，然而， BBR 的具体抗炎机制仍需进一步研究。近年来，研究发现免疫细胞的乙酰化修饰能够调节促炎细胞因子的转录，从而在免疫调节作用中起着重要作用，提示 BBR 可能介导了巨噬细胞中蛋白乙酰化修饰，从而发挥其抗炎活性。因此本文通过比较 LPS 刺激的巨噬细胞在 BBR 处理后赖氨酸乙酰化修饰水平的变化，发现 BBR 诱导的 NF- κ B 亚基 p65 ^Lys310 位点乙酰化显著降低。进一步验证了 BBR 是通过降低组蛋白乙酰转移酶 p300 的活性使 p65 ^Lys310 乙酰化水平降低，从而在体外以及急性和慢性炎症状态下抑制巨噬细胞的炎症反应。

研究结果 1 ： BBR 改变巨噬细胞中总乙酰化赖氨酸水平

文章通过 PCR 确认了 LPS 刺激的 RAW264.7 和 BMDM 细胞在 5 μ M BBR 作用 24 h 后能够使炎症因子 (IL-1 β、 MCP-1 和 TNF- α ) mRNA 水平均显著降低。先前的报道表明， 巨噬细胞中炎症因子的表达与蛋白质乙酰化密切相关 。为了研究 BBR 对炎症因子抑制的具体作用机制，文章检测了 BBR 对 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞和 BMDM 中泛乙酰化水平的影响，发现 LPS 刺激的 RAW264.7 和 BMDM 巨噬细胞中总泛乙酰化蛋白水平明显降低，而 BBR 能够逆转这种降低。 这些结果表明， BBR 可以改变 LPS 诱导的巨噬细胞内蛋白的乙酰化水平，这可能与其抗炎作用密切相关（图一）。

图一

研究结果 2 ： BBR 能够降低 p65 ^Lys310 乙酰化，抑制 NF- κ B 活性

为了全面了解BBR调控的乙酰化蛋白质组，研究者对（con/LPS/LPS+BBR）的巨噬细胞进行了乙酰化修饰组学分析，共定量到1586个乙酰化修饰蛋白和3208个修饰位点。分析各组数据发现BBR改变了LPS刺激的巨噬细胞中蛋白乙酰化分布，作者关注到NF-κB蛋白复合物中RelA蛋白(p65)的K310与K122修饰水平发生了显著的改变，由于ac-p65 ^Lys310 （乙酰化p65 ^Lys310 ）在炎症调节中具有重要作用，因此后续研究聚焦于p65 ^Lys310 乙酰化的动态变化及其功能。蛋白组数据表明在LPS诱导的巨噬细胞中，ac-p65 ^Lys310 表达水平显著升高，而在BBR后显著降低。通过分子生物学实验验证了这一现象， 这 表明BBR能够逆转LPS诱导的巨噬细胞中p65 ^Lys310 乙酰化水平升高。 Lys310位于p65的反式激活结构域，通过促进p65从细胞质向细胞核的易位调节NF-κB活性中起关键作用。为了进一步证实BBR对NF-κB活性的影响，研究者在体外分别检测核及胞浆ac-p65 ^Lys310 和p65的水平，与对照组相比，LPS诱导的ac-p65 ^Lys310 和p65的水平明显升高，而BBR处理则使其显著降低。 说明BBR通过下调巨噬细胞核ac-p65 ^Lys310 抑制p65从细胞质向细胞核的易位和NF-κb的活性（图二）。

图二

研究结果3：p65 ^Lys310 赖氨酸残基突变后，BBR失去了抗炎作用

为了进一步证实BBR是否通过抑制p65在Lys310位点的乙酰化发挥抗炎作用，构建了两个在RAW264.7细胞中有赖氨酸残基突变的细胞系。赖氨酸在310位点突变为精氨酸(K310R)代表了乙酰化的持续抑制。而赖氨酸突变为谷氨酰胺表示乙酰化持续升高(K310Q)。免疫荧光实验表明，BBR处理逆转了p65野生型细胞中LPS诱导的p65总荧光强度和p65核荧光强度的升高，而p65 K310突变后抑制了BBR处理引起的p65易位减弱。NF-κB的活性也呈现相似趋势，p65 K310Q和K310R消除了BBR处理导致的NF-κB活性降低。此外，在p65野生型细胞中，BBR处理显著降低了促炎因子 (IL-1β、MCP-1和TNF-α) 的表达，而在BBR处理的p65 K310Q和K310R细胞中，它们的水平没有发生显著改变。 以上结果表明小檗碱通过降低p65 K310的乙酰化修饰来抑制NF-κB活性，从而发挥抗炎作用。这一结果也在急性炎症和慢性炎症肥胖小鼠模型中加以验证（图三）。

图三

研究结果4: BBR通过调节p300的表达降低Lys310的乙酰化水平

由于乙酰化酶和去乙酰化酶影响p65的乙酰化水平，作者进一步通过分析乙酰化蛋白质组学中p65的PPI网络图来分析多种乙酰化酶和去乙酰化酶的变化，发现了p300是变化最剧烈的乙酰化酶之一，并通过生物学实验验证了BBR可以降低炎症发生时巨噬细胞p300表达的升高。通过IP实验研究BBR在体外调节p300与ac-p65 ^Lys310 结合中的作用，发现在LPS刺激的BMDM细胞中，BBR可以减弱p300对ac-p65 ^Lys310 的直接结合作用，这一部分研究结果表明BBR可以抑制p300活性，从而降低LPS诱导的巨噬细胞中ac-p65 ^Lys310 的表达。

图四

总结：本文通过结合乙酰化修饰组学和分子生物学实验证明了BBR通过下调p300的表达，降低p65 ^Lys310 的乙酰化水平，抑制NF-κB的易位和转录活性，从而逆转巨噬细胞的炎症反应。

撰稿：温宏涛