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东南大学何农跃教授/王志飞教授团队《ACS AMI》：基于核酸适配体的LuminalA型乳腺癌细胞生物标志物的发现与鉴定

时间：2022-11-23 来源：浏览：

东南大学何农跃教授/王志飞教授团队《ACS AMI》：基于核酸适配体的LuminalA型乳腺癌细胞生物标志物的发现与鉴定

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收录于合集

#乳腺癌 6 个

#核酸适配体 3 个

#生物标志物 3 个

#PHB2蛋白 2 个

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精准的分子分型是实现乳腺癌高效个体化治疗的前提。然而，现有生物标志物不足以实现精准的乳腺癌分子分型，迫切需要发现和鉴定新的生物标志物。这对于发展更精准的乳腺癌分子分型体系和高效的个体化治疗具有非常重要的意义。

近日，东南大学生物科学与医学工程学院、生物电子学国家重点实验室何农跃教授团队和东南大学化学化工学院王志飞教授团队利用 Luminal A 型乳腺癌细胞特异性的核酸适配体成功鉴定了特异性表达在 Luminal A 型乳腺癌细胞 MCF-7 细胞膜上的生物标志物 PHB2 蛋白。该蛋白在 MCF- 7 、 SK-BR-3 、 MDA-MB-231 和 MCF-10A 四种细胞的细胞膜上呈差异表达。由于上述四种细胞分别属于 Luminal A 型、 HER2 阳性型、三阴性型乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞，因此，细胞膜表达的 PHB2 蛋白可以作为一种潜在的鉴别 Luminal A 型乳腺癌与 HER2 阳性型、三阴性型乳腺癌和正常乳腺的新型生物标志物及 Luminal A 型乳腺癌治疗的新靶点。这对丰富乳腺癌分子分型的生物标志物和进一步发展更精准的乳腺癌分子分型体系及靶向治疗具有十分重要的价值。相关工作以 “ Identification of PHB2 as a Potential Biomarker of Luminal A Breast Cancer Cells Using a Cell-Specific Aptamer ” 为题，发表在《 ACS Applied Materials & Interfaces 》。

1. 基于核酸适配体 MF3Ec 的生物标志物鉴定

作者首先通过构建基于核酸适配体 MF3Ec 的细胞膜蛋白 pull down 技术，将核酸适配体 MF3Ec 的特异性靶蛋白从细胞膜蛋白中分离和纯化出来。然后利用 SDS-PAGE 电泳、质谱分析、 Western blotting 和 RNA 干扰等试验证明 MF3Ec 的靶蛋白为细胞膜表达的 PHB2 蛋白（图 1 ）。

图 1 . 基于核酸适配体 MF3Ec 的细胞膜蛋白生物标志物的鉴定。（ A ）基于核酸适配体 MF3Ec 的生物标志物鉴定示意图；（ B ） SDS-PAGE 电泳；（ C ）靶蛋白的 Western blotting 分析；（ D ） RNA 干扰；（ E ） RNA 干扰后 MCF-7 细胞与核酸适配体 MF3Ec 的结合能力。

2. 核酸适配体 MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体不存在竞争性结合

为了验证核酸适配体 MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体是否竞争性结合靶细胞，作者通过荧光标记的方法将核酸适配体 MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体与靶细胞结合后进行流式细胞检测分析。结果显示， MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体能够同时结合到 MCF-7 细胞上且二者的荧光信号强度都与单独结合时接近，二者互不影响（图 2 ）。这说明 MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体不存在竞争性结合靶细胞的关系。

图 2 . 核酸适体 MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体结合 MCF-7 细胞的竞争分析。

3. 核酸适配体 MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体均能结合 PHB2 蛋白，但二者具有不同的结合结构域

进一步，利用激光共聚焦荧光显微镜对核酸适配体 MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体在 MCF-7 细胞膜上的结合位点进行亚细胞共定位分析。结果如图 3 所示，绿色荧光的 MF3Ec 与红色荧光的 PHB2 多克隆抗体都能高效地结合到 MCF-7 细胞的细胞膜上。当二者共同孵育时，细胞的荧光信号则变成黄色，提示 MF3Ec 的绿色荧光与 PHB2 多克隆抗体的红色荧光重叠良好。以上结果说明， MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体在 MCF-7 细胞膜上的结合部位一致，但是考虑到二者之间不存在竞争性结合的关系。因此， MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体结合靶蛋白 PHB2 的具体结构域不同。

图 3 . MF3Ec 与 PHB2 多克隆抗体结合 MCF-7 细胞的亚细胞共定位分析

4. PHB2 蛋白在不同的乳腺癌细胞亚型和正常乳腺上皮细胞的细胞膜上呈差异表达

最后，作者通过流式细胞仪检测、荧光成像和 Western blotting 考察了 PHB2 蛋白在 MCF-7 、 SK-BR-3 、 MDA-MB-231 和 MCF-10A 四种细胞的细胞膜上的表达情况。结果如图 4 所示， PHB2 蛋白在 MCF-7 细胞的细胞膜上的表达明显强于其它三种细胞。进一步的 Western blotting 检测结果表明，尽管在四种细胞的总蛋白中 PHB2 蛋白的表达量不存在显著差异，但是在四种细胞的细胞膜蛋白中 PHB2 蛋白的表达量有显著差异。 PHB2 蛋白在四种细胞的细胞膜上呈差异表达， PHB2 蛋白具有特异性鉴别 MCF-7 细胞（ Luminal A ）与 SK-BR-3 （ HER2 阳性）、 MDA-MB-231 （三阴性）和 MCF-10A （正常乳腺上皮细胞）的能力，是一种潜在的 Luminal A 型乳腺癌的生物标志物和治疗靶点。