清华大学魏迪明、中科大方芳 JACS: 基于同源重组的方法组装DNA片段和纳米结构

同源重组（Homologous recombination）是一种在进化上十分保守的DNA修复途径，用于保护基因组的稳定性。在分子克隆领域，同源重组长期以来一直被应用于在体内和体外组装多个DNA双链片段。其中许多组装方案的可行性依赖于多种类型的酶活性，例如目前应用十分广泛的分子克隆方法Gibsonassembly，就利用了DNA外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶这三种酶活性。在分子克隆中，利用酶产生具有互补序列的单链DNA片段对于DNA双链片段的组装是必不可少的，而DNA纳米结构的自组装也依赖于单链DNA片段的碱基互补配对。

运用这种思路，研究团队报道了一种酶促组装具有重叠片段的DNA高级结构和双链片段的方法。研究的设计引入了一种具有3’至5’外切酶活性的DNA聚合酶（Q5 DNA聚合酶）来产生单链DNA粘末端，以实现特定的粘末端互补配对。通过精心的序列设计，Q5 DNA聚合酶的外切酶活性可以在只存在dTTP（不含有dATP、dCTP和dGTP）的情况下，消化预定序列3’末端只含有A，C和G核苷酸的部分。当酶作用到T核苷酸的位点时，由于体系中dTTP的存在，聚合酶活性会发挥作用，与外切酶活性进行一场“拔河”拉锯，从而使得消化作用被终止在特定位点。

图1.Q5 DNA聚合酶的聚合酶活性（左）和外切酶活性（右）的“拔河”拉锯

利用这种同一个酶中不同类型酶活性的对抗，研究实现了DNA纳米结构的自环化、同源多聚体以及包括二聚体、三聚体和四聚体在内的多种异源多聚体，复杂度最高达到了25个单元的一次性组装。研究还将此方法改进并应用回分子克隆领域，实现了“单一酶，一锅法”的体外DNA双链片段组装。

图2.DNA纳米结构和双链片段的组装原理

相关研究成果由清华大学生命科学学院魏迪明分子设计课题组（MADlab）和中国科学技术大学生命科学与医学部方芳课题组合作完成，论文题目为“具有重叠序列的DNA纳米结构和双链片段的酶促组装”（Enzymatic assembly of DNA nanostructures and fragments with sequence overlaps），于4月17日在线发表于《美国化学学会志》（ Journal of the American Chemical Society） 。

清华大学生命科学学院2020级博士生 陈蓉 为本文第一作者，清华大学生命科学学院 魏迪明 副教授和中国科学技术大学生命科学和医学部 方芳 教授为本文的共同通讯作者，清华大学生命科学学院已毕业的2018级本科生任洁灵和医学院医学实验班2018级本科生杨雨帆在清华大学生命科学学院本科生课程“核酸纳米结构的分子设计 ” 中主导自主课程项目而为此研究作出了最初的探索。该研究得到科技部、国家自然科学基金委、清华-北大生命科学联合中心、清华大学春风基金、中国科学技术大学校创新团队培育项目、中国科学技术大学校青年创新重点基金项目等的资助。

原文链接

https://doi.org/10.1021/jacs.3c01214

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