科研 | 江苏省农科院：不同氮素利用效率的水稻基因型根际分类和功能细菌群落选择（国人佳作）

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编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

氮肥的过度使用造成了一系列的环境问题，提高水稻作物的氮肥利用效率备受关注。 由于开发氮高效水稻基因型是一种可行的解决方案，因此阐明氮高效水稻基因型的微生物学特性具有重要意义。 我们进行了田间试验， 种植了16种基因型的水稻，并研究了水稻氮利用效率和产量。采用实时PCR和Illumina测序技术研究了根际氮循环相关基因的丰度和细菌群落结构。 结果表明，在分类和功能水平上，水稻基因型在根际富集了特定的细菌群落。富集菌主要参与氮转化、三价铁还原、有机物降解和硫转化等功能。我们观察到产量与根际功能菌的丰度之间有很强的相关性，尤其是变形菌门（Proteobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）。亚硝酸盐还原酶和反硝化基因分析表明，根际反硝化活性与氮利用效率呈负相关。我们推断， 反硝化细菌数量越少会导致根际氮损失减少，从而增加有效氮并提高水稻产量。 本研究揭示了不同氮利用效率水稻基因型根际功能菌的聚集规律，为提高氮利用效率和减少施肥提供了有价值的信息。

论文ID

原 名： Taxonomical and functional bacterial community selection in the rhizosphere of the rice genotypes with different nitrogen use efficiencies

译 名 ： 不同氮素利用效率的水稻基因型根际分类和功能细菌群落选择

期刊 ： Plant and Soil

IF： 4.192

发表时间： 2021.10.26

通讯作 者： 高岩

通讯作者单位： 江苏省农业科学院农业资源与环境研究所

DOI号： 10.1007/s11104-021-05170-x

实验设计

前言

水稻是世界上最重要的农作物之一。中国是水稻生产大国，水稻种植占其总耕地的26%，占全球水稻产量的29%。在过去的50年中，全球水稻产量一直在增加，部分原因是化肥的使用增加，尤其是氮肥。

氮是一种不可缺少的营养元素，与作物产量密切相关。然而，氮肥的利用率普遍较低，氮肥的表观回收率（即种植季节结束时肥料氮在植物地上部生物量中的回收百分比）平均仅为33%。自20世纪80年代以来，合成氮的过度使用一直是一个问题，而且越来越严重。农田中剩余的氮从农业系统中逸出，成为破坏陆地和水生生态系统并导致全球气候变化的重要污染物来源。因此， 提高水稻氮肥利用率是近年来备受关注的问题。开发和鉴定水稻氮高效基因型是提高氮肥利用率的一种经济可行的方法。

植物依靠根和微生物之间的有益相互作用来获得养分、促进生长和抑制疾病。在根际热点地区，植物分泌物可作为底物、信号分子、引诱剂、刺激剂、抑制剂或驱避剂，促进植物与微生物之间的相互作用。大量文献表明， 植物选择和吸引特定的微生物，并改变根际微生物群落的组成。 例如，根系分泌物，如对香豆酸和茉莉酸，可导致参与植物防御的某些微生物群富集，如芽孢杆菌属（ Bacillus ）、芽孢杆菌目（Bacillales）、类芽孢杆菌（ Paenibacillus ）和赖氨酸芽胞杆菌属（ Lysinibacillus ）。根多糖诱导一些有益细菌产生生物膜基质，改善土壤质量，形成微生物群落。不同的水稻基因型分泌不同的根系分泌物。 不同基因型水稻根系分泌物的组成和浓度以及总有机碳含量不同，从而驱动了根际微生物群落的聚集。 水稻根系相关细菌群落也受到基因型的影响，基因型对根际微生物群落的影响高达30%。

以前的研究表明，植物可以选择细菌功能群，如氨氧化剂或固氮剂，为植物生长创造最佳环境。根际微生物，如固氮菌属（ Azotobacter ）、固氮螺菌属（ Azospirillum ）、梭菌属（ Clostridia ）、草螺菌属（ Herbaspirillum ）、拟茎点霉属（ Phomopsis ）、 Pleomorphomonas 和红杆菌属（ Rhodobacter ），通过硝化和固氮与农业生态系统功能有内在联系，并因此产生硝酸盐（NO ₃ ^- ）或铵（NH ₄ ⁺ ），影响植物氮的吸收和生产。经验证据表明，许多微生物受到水稻植物的影响，包括芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）等。Zhang等人（2019）证明， 籼稻和粳稻品种吸收了不同的根系微生物群 。根据功能注释，53.3%的富含籼稻的功能与氮循环有关。

本研究的目的是 研究不同氮利用效率的水稻基因型如何形成根际细菌群落，并阐明根际功能微生物与水稻基因型产量之间的关系 。这项研究可能为提高氮肥利用效率和减少肥料使用提供有价值的信息。

结果

1 不同水稻基因型的产量和氮回收效率

收获后测量每个水稻基因型的产量，产量范围为7.3 ± 0.18至10.15 ± 0.1 t ha ^-1 。在16个基因型中，V6的产量最高，显著高于V2、V3、V4、V5、V8、V9、V10、V13、V14和V15。同时，V10和V15为低产基因型，分别为7.99 t ha ^-1 和7.3 t ha ^-1 。此外，V6的氮同化量达到129 kg ha ^-1 ，是最低产量基因型（V15，86 kg ha ^-1 ）的1.5倍。V10、V13、V14、V15和V16也是低氮摄取基因型，氮摄取范围为90至94 kg ha ^-1 。

为了进一步确定基因型的氮同化能力，分析了氮肥的回收效率（RE _N ）。如表1所示， V6的RE _N 显著高于其他15个基因型，V7的RE _N 显著高于其他11个基因型（V1、V2和V12除外） 。V10和V15的RE _N 显著低于V1、V2、V3、V8、V9、V11、V12和V16，而V13和V14的RE _N 在各基因型中相对较低。

 

表1. 不同基因型水稻植株的栽培品种、产量、氮含量及其分布。数值为平均值 ± 标准差（n=3）。 

*统计显著性设置为 P  < 0.05，使用Duncan多重比较。表中相同的字母表示无显著差异。

粗体是指16S rRNA基因测序的选定基因型。

 

2 参与氮循环的功能基因的丰度

测定了水稻基因型根际土壤和土壤中氮循环基因的丰度，包括氨氧化基因（ amoA ）、亚硝酸盐还原基因（ nirS/nirK ）、一氧化氮还原基因（ norB ）、一氧化二氮还原基因（ nosZ ）和固氮基因（ nifH ）。

根际土壤中氨氧化基因 amoA 的丰度明显低于非根际土壤。在16个根际土壤样品中，V12、V1和V3的 amoA 丰度相对较高，但无显著差异。同样，在不同基因型的非根际土壤和根际土壤中， nifH 的丰度也没有太大差异（图1）。根际 nirS 的丰度显著低于非根际土壤中的丰度。不同水稻基因型根际 nirS 丰度差异不显著。V10、V15和V16根际的 nirS 丰度显著高于V3和V6。V9和V10根际 nirK 的丰度远高于其他样品。同时，V3、V4、V5、V6和V7的根际 nirK 丰度显著低于除V1和V14外的其他基因型。总体而言， 土壤样品中 norB 和 nosZ 的丰度表现出不同的趋势。根际土壤和非根际土壤中 norB 和 nosZ 的含量差异不显著。 V1、V2、V3、V4、V5和V6的非根际土壤和根际土壤中 norB 的丰度较高，而其余基因型的丰度较低（图1）。 nosZ 在非根际土壤中的丰度最高，而在根际，V10、V15、V16和V13的丰度显著高于V3、V6和V7。

 

图1. 参与氮循环的功能基因的丰度。a， amoA ；b， nifH ；c，左y轴为 nirK 的丰度，右y轴为 nirS 的丰度；d，左y轴为 norB 的丰度，右y轴为 nosZ 的丰度。向下箭头表示选择的四种用于测序的水稻基因型。误差线表示标准差（SD，n=3)。

 

3 不同水稻基因型根际土壤和非根际土壤的细菌群落

根据各基因型的氮回收效率和功能基因丰度，我们选择V6和V7作为高RE _N 基因型的代表，V10和V15作为低RE _N 基因型的代表。细菌群落结构分析表明，无论是在非根际土壤还是根际土壤中，主要细菌门为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）（图2a）。变形菌门和绿弯菌门占据了所有门中最大的生态位。

为了比较所选基因型根际和非根际土壤中的细菌群落结构，在门水平上进行了加权unifrac距离分析（图S1）。结果表明， V6和V7的群落以最短距离划分为同一类群，这说明高RE _N 基因型的微生物群落在门水平上更加相似。 另一方面，低RE _N 基因型（V10和V15）的根际细菌群落没有聚集成一个分支。V15和氮高效基因型（V6和V7）之间的距离比V10和氮高效基因型之间的距离短。非根际土壤与根际样品的加权unifrac距离最长。这种现象在属水平上也存在。根际土壤中几个属的丰度显著高于非根际土壤中的丰度，包括地杆菌属（ Geobacter ）、 Haliangium 、厌氧粘细菌属（ Anaeromyxobacter ）、 Candidatus Solibacter 、厌氧绳菌属（ Anaerolinea ）、芽单胞菌属（ Gemmatimonas ）、酸杆菌属（ Acidibacter ）、 Terrimonas 、 Flavisolibacter 、马赛菌属（ Massilia ）、未鉴定的酸杆菌门（unidentified Acidobacteria）和δ变形菌纲（Deltaproteobactera）。图2b中的热图显示了不同水稻基因型的非根际土壤和根际土壤间 P 值的不同属。

 

图2. 四种选定水稻基因型（V6、V7、V10和V15）的根际和非根际土壤（BS）中的细菌群落分布。（a），内环指属，外环指门。（b），根际和非根际土壤中最丰富的35个属。棕色方块， P  < 0.01；红色方块， P  < 0.05；白色方块， P  > 0.05。

 

基于所有可用的OTUs，我们使用加权unifrac距离的主坐标分析来显示水稻基因型之间细菌群落的差异（图3a）。第一主坐标轴（PCo1）解释了44.42%的变化，而第二主坐标轴（PCo2）解释了23.20%。正如预期的那样，根际细菌群落与非根际土壤中的细菌群落分离。V6、V7和V15的细菌群落聚集在一起，而V10的样本则与其他样本分离。

根据不同系统发育水平的细菌类群丰度，绘制了4个水稻基因型根际土壤中的细菌类群（图3b）。仅在V7和V10之间的纲水平上观察到热原体纲（Thermoplasmata）的显著差异。 根际土壤在目和科水平上没有显著差异。 V6和V10之间的不同属为蔷薇色丝状菌属（ Rhodomicrobium ）（ P  < 0.01）和霍尔德曼氏菌属（ Holdemanella ）（ P  < 0.05），而 Desulfopila （ P  < 0.01）和脱硫叶菌属（ Desulfobulbus ）（ P  < 0.05）的丰度在V10和V15之间分别有显著差异。

 

图3. 水稻基因型显著影响根际细菌群落。a，主坐标分析（PCoA）使用加权unifrac方法着色来描述水稻基因型（V6、V7、V10、V15）中采集的根际土壤样品；b，水稻基因型根际土壤在纲和属水平上的不同细菌群。*表示差异显著（ P  < 0.05）；**表示差异极显著（ P  < 0.01）。

 

4 细菌类群与土壤理化性质的关系

采用冗余分析（RDA）说明细菌类群（门水平）与不同基因型土壤理化性质之间的关系（图4）。结果表明，绿弯菌门与土壤全氮的Pearson相关系数（ρs）为0.509（ P  = 0.044），而变形菌门与土壤碱解氮的相关系数为0.671（ P  = 0.004）（图S3）。此外，酸杆菌门与土壤全氮呈负相关（ρs = -0.616， P  = 0.304），且土壤全磷与奇古菌门（Thaumarchaeota）呈显著正相关。 根际土壤样品的总碳、有效磷和亚硝酸盐还原酶活性与主要细菌类群的丰度没有显著相关性。 根据RDA，我们可以发现V6更倾向在根际募集绿弯菌门和厚壁菌门，而V15则募集酸杆菌门。这些细菌群在根际营养元素循环中起着重要作用，这可能受不同基因型水稻根系分泌物的影响。

 图4. 不同水稻基因型在门水平上主要细菌类群和土壤理化性质的冗余分析。黄色方块，V6；绿色三角，V7；蓝色圆圈，V10；紫色方块，V15。TC，总碳；TN，总氮；TP，总磷；AN，碱解氮；AP，速效磷；OM，有机质；NR，亚硝酸还原酶活性。

讨论

1 水稻根际中的特殊细菌

此前的研究表明，变形菌门是水稻根际最优势的门，其比例高达45%。在我们的研究中也发现了这种现象，即在不同基因型的根际中，变形菌门的丰度在32.3%到34.5%之间。 据报道，酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、疣微菌门和放线菌门也是水稻根际的富集菌群。 这些结果与我们的结果一致，即在根际变形菌门（地杆菌属、 Haliangium 、厌氧粘菌属、酸杆菌属、马赛菌属和未鉴定的δ变形菌纲）、酸杆菌门（ Candidatus Solibacter 和未鉴定的酸杆菌门）、芽单胞菌门（芽单胞菌属）、拟杆菌门（ Terrimonas 和 Flavisolibacter ）和绿弯菌门（厌氧绳菌属）的丰度显著高于非根际土壤。Flavisolibacter、厌氧绳菌属和Solibacter中未鉴定类群、酸杆菌门、δ变形菌纲、γ变形菌纲、Rokubacteria和梭菌目在非根际土壤和根际土壤间丰度差异极显著（ P  < 0.01）。根据它们在属水平上的功能，水稻植物选择的细菌分类群可以分为四组：i）氮的转化，ii）三价铁的还原，iii）复杂有机化合物的生物降解，iv）硫的转化（图5）。

 

图5. 在 P  < 0.05水平上，BS（非根际土壤）和水稻基因型（V6、V7、V10、V15）中变化的功能菌属丰度。数值是每次处理的三份样品的平均值。右侧标注了各属的功能，（竖线方块）：氮的转化；（黑色方块）：还原三价铁；（灰色方块）：复杂有机化物的生物降解；（空方块）：硫的转化。数值是每次处理的三份样品的平均值。

 

在根际，土壤微生物在与植物养分获取相关的氮循环中起着至关重要的作用，包括固氮、氨氧化、硝化和反硝化。根据先前的报道， Terrimonas 、厌氧粘细菌属和根际中未鉴定的酸杆菌门中的某些功能菌的富集可能是氮转化的主要原因。 Terrimonas 能够利用大气中的氮进行生长，并拥有一些独特的固氮系统，而厌氧粘细菌属分离株可以催化硝酸盐、亚硝酸盐和一氧化二氮的还原。据报道，酸杆菌门作为反硝化菌在土壤氮循环中起着重要作用。

水稻植株选择的另一个功能菌群在三价铁还原方面是有效的。在水稻根际观察到地杆菌属、厌氧粘细菌属和 Acidibacter 的筛选。据报道，这些菌属负责土壤中的三价铁还原。然而，根际土壤中 Geothermobacter 、披毛菌属（ Gallionella ）和 Paludibaculum 的丰度低于非根际土壤中。据报道，这些属也与三价铁还原有关。对参与铁还原的细菌的筛选表明，根际区域的氧化-还原过程与非根际土壤不同。

另一组富集细菌 具有降解复杂有机化合物的能力。 Haliangium 、马赛菌属、 Candidatus Solibacter 、芽单胞菌属和厌氧绳菌属在根际的丰度显著高于非根际土壤 。据报道，非根际土壤使用复合基质，如几丁质、半纤维素、果胶、淀粉和木聚糖。由于植物向根际分泌大量的根系分泌物，这类细菌可能参与这些复杂基质的代谢和分解。相反， Dechloromonas 可以利用硝酸盐作为电子受体完全矿化单芳香化合物。复杂有机化合物的降解可确保为其他微生物的生长提供稳定的碳、氮或其他营养源。

此外，与硫循环密切相关的硫杆菌属和 Desulfobacca 在根际的丰度显著低于非根际土壤。硫杆菌属能够氧化各种还原硫物质（FeS、S ⁰ 、S ₂ O ₃ ^2- 、S ₄ O ₆ ^2- ），而 Desulfobacca 可以使用硫酸盐和无机硫化合物作为末端电子受体。这些反应与碳、铁和氮循环耦合。这些细菌的低丰度可能与根际分泌物中的营养物质有关。

总之，可以推断出显著变化的细菌群落主要活跃在氧化和还原过程，并在氮、碳、铁、硫等生物地球化学循环中发挥作用。

 

2 不同水稻基因型筛选功能菌

植物根际微生物区系组成受土壤来源、施肥水平、水分管理等多种因素的影响，其中自然变异或人为遗传变异产生的基因型对水稻土根际细菌群落有显著影响。

本研究从16个基因型中选择了两个高RE _N 基因型和两个低RE _N 基因型来揭示根际细菌群落的差异。根据我们的结果，具有高RE _N 、V6和V7的水稻基因型显示出相似的细菌群落结构，而具有低RE _N 的V10和V15的根际细菌群落结构彼此不同（图S2、3a、表S4）。V7根际热原体纲的丰度显著高于V10。据报道， 热原体纲作为产甲烷菌和蛋白质降解菌发挥作用，这在碳和氮循环中都至关重要。 V6根际的红微菌属（ Rhodomicrobium ）和霍尔德曼氏菌属的丰度显著高于V10。红微菌属是一种以丙酮、谷氨酸为碳源的紫色光合细菌，也是一种固氮菌。稻田是众多固氮营养生物的栖息地，生物固氮是农业系统中氮输入的重要来源。根际固氮为植物生长提供更多的有效氮（铵），从而促进根系对氮的吸收。在属水平上，V10和V15之间细菌丰度的也存在差异。 Desulfopila 在V10根际的丰度较高，而脱硫叶菌属在V15根际的丰度较高。

根据对氮循环基因的分析，高RE _N 基因型（V6和V7）根际中较低的反硝化基因丰度（ nirK 、 nirS 和 nosZ ）意味着土壤中氮流失水平较低。 根际土壤亚硝酸盐还原酶活性测定也反映了不同基因型根际反硝化作用 （图S2），亚硝酸盐还原酶活性的差异与反硝化基因的差异基本一致。结果表明， 非根际土壤中的亚硝酸盐还原酶活性明显高于根际，而高RE _N 基因型的亚硝酸盐还原酶活性显著低于低RE _N 基因型。 因此，功能微生物促进根际氮循环，为植物生长提供更多的有效氮。

 

3 根际功能菌与植物生产力的关系

为了确定基因型根际土壤中哪些群体与水稻产量相关（或负责），分析了产量与主要细菌群落在门和属水平上的相关性（表2）。根据Pearson相关系数（ρs），在门水平上观察到绿弯菌门（ρs=0.552）和变形菌门（ρs=-0.550）的产量与优势细菌分类群间显著相关（表2）。绿弯菌门在各种环境中都非常丰富，具有广泛的代谢和生态作用多样性。变形菌门（α、β和γ变形菌纲）是大多数植物根际中最具优势的类群之一，包括水稻、玉米、燕麦、拟南芥、大豆等。该门细菌在根际的许多生物地球化学过程中都很活跃。γ变形菌纲的成员是重要的水稻定植菌，广泛存在于水稻根际和叶际。值得注意的是， 假单胞菌属是最丰富的反硝化细菌，也是γ变形菌纲的重要成员。 变形菌门的减少可能与降低根际土壤中的氮损失有关，从而导致作物产量的增加。碱解氮含量与变形菌门丰度之间的正相关可能与不同基因型水稻对氮的吸收能力不同有关（图4；表1）。根据RDA结果以及主要细菌群落丰度与基因型之间的相关性，我们推测高RE _N 基因型更倾向于募集在根际氮循环中起作用的细菌。同时，基于对反硝化基因（ nirK 、 nirS 、 norB 和 nosZ ）的分析，可以推断出氮高效基因型（V6和V7）的反硝化基因丰度低会导致土壤有效氮的流失。土壤亚硝酸盐还原酶活性分析证实了这种推测（图S2）。V10和V15的根际反硝化反应更为活跃，导致根际氮损失更多，有效氮减少。

这些结果与根际功能细菌群落随不同RE _N 的水稻基因型发生变化的假设一致，即可能通过调节根际功能细菌的养分循环影响水稻产量。

 

表2. V6、V7、V10和V15基因型的门水平细菌丰度与植物产量之间的Pearson相关系数（ρs）。

*统计显著性设置为 P  < 0.05，采用双尾试验。

结论

我们的结果表明，氮利用效率不同的水稻基因型丰富了根际定植的微生物群落。这种选择在分类学和功能水平上塑造了根际细菌。所涉及的功能包括氮转化、三价铁还原、有机化合物生物降解和硫转化。根际功能菌群与产量密切相关，尤其是门水平的变形菌门和绿弯菌门。 对根际氮循环基因丰度和土壤酶活性的进一步的研究表明反硝化活性相对较低，这说明功能菌可能负责提高根际氮的有效性，从而提高水稻产量。 本研究将为不同氮利用效率水稻基因型根际功能菌的构成提供有价值的知识。

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