吉林大学徐抒平教授课题组近年来工作概览
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发表于
徐抒平，现为吉林大学化学学院超分子结构与材料国家重点实验室领军教授。2001年毕业于吉林大学化学学院化学专业获学士学位，2006年毕业于吉林大学理论化学研究所获博士学位。同年留校任教。2007年2月-2008年7月在美国北达科他大学化学系做博士后。2019年10月-2020年5月澳大利亚麦考瑞大学生物光子学卓越中心（CNBP）任PI。2008年至今主持国家自然科学基金项目5项，吉林省科技厅重大招标专项1项。发表学术论文240余篇，他引4700余次，撰写书章节3项，授权专利10余项，h因子40。现为中国物理学会光散射专业委员会委员，《光散射学报》编委，吉林省检测技术学会理事及光谱技术分会理事长。曾获吉林省科技进步一等奖（2008年），中国石油化工协会二等奖（2016年），中国商业协会一等奖（2016年），吉林省自然科学学术成果奖5项。
https://orcid.org/0000-0002-6216-6175
https://www.researchgate.net/profile/Shuping-Xu
徐抒平课题组在近五年来致力于发展用于细胞体系分析的新型表面增强拉曼散射（SERS）光谱技术以及成像分析平台。研究工作可根据检测目标物分为三类（图1）——胞内物质、细胞膜组分以及细胞外泌物。以下选取近五年来的成果进行介绍。
（一）基于液滴微流控的SERS分析平台用于单细胞外泌物的分析
细胞是组成生命体结构和维持生命活动的基本单位。异质性是细胞的显著特征。传统的细胞分析方法大多建立在大量群体细胞基础之上，体现了细胞群体的平均情况，致使细胞与细胞之间的差异性被忽略。尤其在癌症早期诊断中，恶性肿瘤细胞亚群的信息往往因为数量较少而被掩盖在大量正常细胞中无法被甄别出。发展和建立一个强有力的单细胞分析工具，以此来研究单个细胞的独特性质，以及这些因素如何影响它们的表型和功能，对认识细胞功能以及疾病产生机制具有重要的意义。
液滴微流控技术被认为是高通量单细胞筛选研究的可行技术之一。该技术通过互不相溶的油水两相将单个细胞包裹到皮升体积的水相液滴中，可以有效地隔绝细胞之间的物质交换和能量传递；液滴可以进行off-chip的细胞培养，将细胞代谢物限制于液滴中；该技术对检测试剂的消耗量大大降低。徐抒平课题组在近些年采用液滴微流控技术与SERS分析方法相结合，发展了一系列用于单细胞外泌物的分析技术，该技术的实现可为单细胞代谢组学研究提供帮助。
2019年，该课题组将表面增强共振拉曼散射（SERRS）效应引入到液滴微流控平台中，对单个细胞中极少量碱性磷酸酶（ALP）实现超灵敏分析（
Lab on a Chip
,
2019
,
19
, 335-342）。将细胞悬浮液、底物BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸）以及SERS增强活性金纳米粒子混合作为水相，生成油包水型液滴。BCIP作为酶底物可以被ALP特异催化并进一步氧化形成一种靛蓝染料衍生物BCI。BCI在633 nm激光激发下，具有很强的SERS活性和拉曼共振增强效应，通过监测催化产物BCI的SERRS光谱实现对单细胞ALP活性的评价。实验对比了两种不同细胞系（HepG2和BNL.CL2）表达ALP的情况。相比于正常细胞，HepG2细胞ALP表达水平高出了40%。此外，包裹在液滴中单独的HepG2细胞ALP活性的波动范围较群体细胞大一些（图2a-c）。该SERRS-微液滴方法还可动态追踪抑制剂（原钒酸钠和索拉非尼）作用HepG2细胞后ALP的表达情况。
图2. 液滴微流控-SERRS平台用于单细胞碱性磷酸酶（ALP）分析, 图片来源：
Lab on a Chip
此外，该课题组报道了一种基于磁场放大SERS策略的液滴微流控技术（
Anal. Chem
.,
2019
,
91
, 2551−2558），用于同时检测单细胞分泌的两种细胞因子（图3）。将免疫磁（MNs@A
b
2
）和免疫银纳米粒子（AgNPs@A
b
1
）与单细胞共同封装于液滴中，其中MNs@A
b
2
表面修饰了拉曼报告分子——4-氨基联苯（4-ABP）和乙酰胺（AAD）。包裹于液滴中的细胞产生的细胞因子会对四种探针产生免疫识别效应以及磁驱动作用，于是AgNPs@A
b
1
和MNs@A
b
2
发生自发聚集（图3c），这使得位于MNs@A
b
2
上的拉曼信标分子的SERS信号“开启”，从而实现对VEGF/IL-8的高灵敏（1.0 fg/mL, 图3b）、高重复性、高选择性的检测。该工作检测了三种癌细胞系在单细胞水平上表达VEGF和IL-8的情况，结果表明三种细胞在表达IL-8方面呈现明显的细胞差异性；A549和SGC细胞相比IL-8表达更多的VEGF，而MDA-MB-231细胞呈相反的趋势。
图3. 基于液滴微流控技术SERS检测单个细胞分泌的两种细胞因子VEGF和IL-8。（a）传感体系在聚集时间为0和25 min时的SERS光谱；(b) 4-ABP谱峰中相对强度与VEGF浓度的线性关系图;（c）不同聚集时间下液滴的光学照片（I-VI：0-25min）。图片来源：
Anal. Chem.
图4. 微液滴-SERS平台用于检测单细胞产生的三种代谢物。图片来源：
Anal. Chem.
同年，该课题组采用多功能
Fe
3
O
4
@AgNPs 复合纳米材料形成的双重热点结构实现单细胞分泌的多种代谢物的免标SERS分析（
Anal. Chem
.,
2019
,
91
, 15484-15490）（图4）。细胞分泌的多种代谢物（丙酮酸、乳酸和三磷酸腺苷）能够直接吸附在
Fe
3
O
4
@AgNPs上，利用
Fe
3
O
4
的磁作用下能够在液滴中自发聚集的特点，形成大量不同尺度的热点结构，极大地增强了代谢物的拉曼信号。据此实现了液滴中单个细胞产生的三种代谢物的分析（图4a-c）。实验对比了三种细胞在分泌代谢物时的差异，其中MCF-7具有最高的分泌水平和最大程度的异质性；皂素作用于三种癌细胞后，HepG2和SGC细胞在代谢物分泌活动中相较于作用前呈现较大的细胞间差异性，而MCF-7细胞呈相反趋势；此外，对比不同数量癌细胞分泌代谢物的情况。结果显示细胞间的相互作用能够影响细胞代谢物的分泌活动，且不同种类的细胞呈现出不同的变化趋势。
最近，该课题组发展了一种在细胞膜表面进行精细的生物偶联的单细胞分析策略（
Anal. Chem
.,
2022
,
94
, 10375−10383;
Anal. Chem
.,
2022
,
94
, 6591−6598）。通过被检测外泌蛋白作为桥梁，将报告探针锚定在细胞膜表面形成免疫三明治结构，实现外泌因子在细胞膜表面的富集效应和报告探针的信号放大效应（图5）。该方法用来追踪单细胞分泌VEGF的含量，并结合多种算法对不同细胞系的VEGF进行异质性分析。该研究提出了在靶细胞表面构建传感策略（target cell-following）的新模式，解决了以往研究中将单细胞和额外的传感元件（如磁珠）同时封装在一个液滴中的操控难度，同时提高了液滴的有效率。
图5. 细胞膜表面修饰以及用于单细胞外泌蛋白的SERS分析策略。a)-c) PMA诱导单细胞分泌VEGF的动态监测。图片来源：
Anal. Chem.
（二）借助靶向细胞器探针的细胞内组分及微环境的SERS检测
细胞器会参与许多细胞生命活动，其代谢异常或功能紊乱与细胞凋亡、心血管疾病以及癌症的发生和转移密切相关。对亚细胞结构、微环境及其异常状态的探索有助于更深入地了解许多病理机制，有望实现疾病的早期诊断和有效治疗。细胞器也是药物的靶向部位，在许多靶向治疗策略中发挥着重要作用。
图6. 不同细胞器靶向纳米探针的制备及在亚细胞靶向纳米探针的辅助下进行细胞核、线粒体和溶酶体的SERS光谱采集。图片来源：
ACS Appl Mater Interfaces
要想实现亚细胞的靶向SERS检测，如何将SERS活性纳米粒子递送到目标位置是首先要解决的关键问题。徐抒平课题组通过在SERS活性的金纳米棒表面修饰可介导细胞内化的跨膜肽和靶向肽（图6），有效地帮助这些SERS探针跨细胞膜以及定向运送到特定细胞器，从而使细胞核、溶酶体、线粒体的原位免标记SERS光谱探测成为可能（
ACS Appl. Mater. Interfaces
,
2018
,
10
, 7910-7918；
Anal. Bioanal. Chem
.,
2018
,
410
, 585-594）。
进而，通过细胞器提取，在保持细胞器活性和功能的前提下，将之与SERS活性纳米粒子混合进行SERS检测（图7），从而获得了细胞核（包括核内蛋白以及核酸）（
Anal. Bioanal. Chem
.,
2019
,
411
, 6021-6029）、线粒体（
J. Raman Spectrosco
.,
2020
,
51
, 602-610）、溶酶体（
Anal. Chem
.,
2021
,
93
, 38, 13038）等组分的拉曼指纹光谱，丰富了细胞内组分的拉曼图谱库。
图7. 用原位和非原位方法检测线粒体的SERS示意图。图片来源：
J. Raman Spectrosco.
在获取细胞器的SERS光谱之后，该团队进一步用SERS光谱揭示一些外界刺激和影响因素对细胞器的作用，从分子层次理解各类细胞器的应激反应和生理过程。先后探究了化疗药物阿霉素（
Anal. Chem.
,
2017
,
89
, 2844-2851）、降糖药二甲双胍（
Talanta
,
2021
,
232
, 122442）对细胞核产生的影响；光敏剂Ce6对癌细胞光动力PDT治疗后导致细胞核的变化（
Front. Chem
.,
2019
,
6
, 665）；超碳点对癌细胞的光热治疗对线粒体的损伤情况（
Carbon
,
2020
,
156
, 558-567）；吲哚菁绿ICG产生的光热治疗PTT与光动力治疗PDT协同作用对提取的线粒体的影响（
Analyst
,
2019
,
144
, 5521-5527）；在饥饿效应诱导的细胞自噬过程中提取的溶酶体的动态变化（
Anal. Chem
.,
2021
,
93
, 38, 13038）。
图8. 光敏剂Ce6光动力治疗肝癌细胞过程中线粒体内的纳米探针的TEM及SERS检测pH动态变化。图片来源：
Anal. Chem.
在建立细胞器靶向探针技术之后，该课题组为细胞器靶向SERS传感纳米探针赋予传感功能，使之成为对胞内微环境（pH、活性氧ROS）分析的有力工具。实现了对细胞核、溶酶体、线粒体内pH值的分析（
Nanoscale
,
2018
,
10
, 1622-1630），并比较了正常细胞和癌细胞的细胞器pH的差异；在光敏剂Ce6光动力治疗肝癌细胞过程中探究线粒体内pH的动态变化（图8，
Anal. Chem
.,
2020
,
92
, 6081-6087）；在金纳米棒产生的PTT效应下线粒体内ROS水平的动态跟踪（
Sens. Actuat. B
,
2019
,
285
, 84-91）；电刺激下细胞核/线粒体内ROS水平的评价（
Anal. Bioanal. Chem.
,
2022
,
414
, 6965–6975）。
基于微操作可将光纤尖端、针尖、微电极等探入到细胞体内实现原位测量。这些方法与通过金属纳米粒子主动或被动内化来实现目标微区域测量的方法不同，它们可以准确地到达细胞内部感兴趣的位置。徐抒平团队在将SERS活性光纤引入到单细胞微操作中，用于细胞内微环境的SERS探测（图9）。通过动态光谱处理和分析，这些微探针为监测单细胞的胞内微环境提供了一种有效的手段。
图9. 具有光学成像/光谱分析功能的单细胞微操作-分析平台
他们基于以往的研究，通过管刻蚀技术将石英光纤制备成纳米针尖，利用激光诱导银沉积技术在针尖表面制备了SERS传感层，进而将4-巯基吡啶（4-Mpy）修饰在纳米针尖表面，实现了细胞代谢相关的pH检测（
Sens. Actuat. B
,
2019
,
290
, 527-534）。以LO2和HepG2 细胞为模型探究了正常与癌细胞内外pH值的差异性。结果显示两种细胞内外pH值均呈明显差异。与正常细胞相比，癌细胞表现为偏酸的外环境，这与癌细胞有氧糖酵解释放大量乳酸息息相关。进而以三种癌细胞系 MCF-7、HepG2、SGC7901为模型探究了细胞核及细胞质处pH 值的分布情况。在细胞系方面，MCF-7 表现出了与 HepG2、SGC7901不同的分布特征；在核质差异方面，MCF-7和HepG2的核质pH值差异较大。
图10. SERS纳米尖探究单细胞氧化应激事件。图片来源：
ACS Sensors
进而，选取了拉曼探针分子4-巯基苯酚（4-MP）修饰在纳米针尖表面用于细胞氧化应激监测（图10，
ACS Sensors
,
2021
,
6
, 1663-1670）。探究了4-MP在不同浓度梯度的氧化/还原环境中的响应，并解析了该分子的振动特征，绘制了氧化过程/还原过程的标准曲线。在细胞实验中，探究了佛波酯PMA刺激下时间分辨的细胞外环境氧化应激事件以及以NADH为主导的抗氧化应激事件。细胞外环境氧化还原事件的监测为进一步探究氧化应激及抗氧化机制与细胞增殖与凋亡之间的关系提供了实验依据。
（四）基于多模共振耦合的界面SERS分析技术用于膜蛋白分析
膜蛋白在细胞物质交换和信号识别中起着重要的作用，在分子水平上探讨膜蛋白的结构和功能具有非常大的挑战。由于跨膜蛋白具有生物毒性的亲水性-亲脂性杂化结构域，且难以溶解于溶剂中进行进一步的纯化和结晶，这使得已有的蛋白质表达纯化分析技术在膜蛋白研究方法中受阻。此外，膜蛋白在磷脂上的分布呈不对称性，且与脂阀、糖链能形成动态的、大小可变的组装体，并协同行使功能。因而能实现对细胞膜原位观测的研究意义重大。基于标记成像的荧光成像在膜蛋白分析中具有重要参考价值，但常带来一些不利的因素，如常用的细胞膜染料容易内吞、标签接枝需要长时间的细胞共培养和繁琐的程序，以及染料容易光漂白等。因此，亟待发展一种无标记细胞膜原位分析方法。
图11. 消逝场激励等离激元用于细胞膜蛋白SERS分析 图片来源：
JPCL
为了获得高质量的膜蛋白的原位SERS信号，徐抒平课题组探索了一种具有普适性的高灵敏SERS研究细胞膜蛋白免标记分析方法（
J. Phys. Chem. Lett
.,
2021
,
12
, 10720）（图11）。该技术以消逝场激励的银纳米粒子作为SERS基底，将提取的细胞膜包裹在银纳米粒子表面，使得膜蛋白可以处于增强的局域电场中，解决了SERS在研究细胞膜蛋白体系中遇到的普适性和本征信号强度弱的问题。该方法对心磷脂膜上的细胞色素c的检测限可以达到2×
10
-7
M。通过细胞膜体外重建，研究细胞膜表皮生长因子受体EGFR与其抗体anti-EGFR以及EGF结合的位点分别与苯丙氨酸和脯氨酸相关。该研究不仅为细胞膜蛋白分析提供了一种高灵敏度和可行的方法，而且为膜上蛋白-蛋白相互作用的原位鉴定提供了一种有用的工具，对于跨膜蛋白的功能和作用的原位研究具有一定价值。
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