Cell Discov | 液-液相分离对胰岛素信号的时空调控

大家好，今天和大家分享一篇 2022 年发表于 Cell Discovery 期刊的研究论文， Spatiotemporal regulation of insulin signaling by liquid–liquid phase separation ，通讯作者是来自南京大学的陈帅教授，国家杰出青年基金获得者，教育部“模式动物与疾病研究重点实验室”主任，主要从事代谢生理和疾病研究。

研究背景：

胰岛素是人体重要的代谢激素，参与多种细胞功能与代谢平衡的维持。由于胰岛素抵抗而引起细胞代谢损伤是近几十年来全球流行的糖尿病的病理基础，为此，明确并干预胰岛素抵抗机制是治疗糖尿病所必需的。

胰岛素受体的酪氨酸激酶可以发生自身多位点磷酸化修饰，进而磷酸化胰岛素受体底物（ IRS ）； IRS 招募 p85-PI3K 和 p110 亚基将 PI(4,5)P2 转化为 PIP3 ， PIP3 继续招募下游激酶包括 PDK1 和 PKB 到质膜， PKB 发生磷酸化后被胰岛素激活，而后在多器官中磷酸化不同底物以应对餐后营养物质和多种离子的激增。

上述这些信号蛋白或激酶常聚集在微结构域中，以促进信号转导在时空中的运转。液 - 液相分离（ LLPS ）是蛋白发生聚集压缩成一种无膜细胞器的液滴状态，这种状态能够促使分子机制而调控多种疾病进程。通常发生 LLPS 的蛋白会内含一段固有无序区（ IDRs ），并且 LLPS 的发生与否与浓度高度相关。本研究中，作者探讨了 LLPS 与胰岛素信号转导之间的潜在关系，并揭示 LLPS 通过调节多种信号转导成分在胰岛素信号转导的时空调控中发挥关键作用。

研究结果：

胰岛素通路富集蛋白具有 LLPS 潜力：

通过 KEGG 富集分析胰岛素信号通路蛋白，在 173 个蛋白中认为 77 个蛋白具有可能发生 LLPS 的特性，比人类蛋白组与胰岛素通路蛋白的 LLPS 发生率都要高，认为胰岛素信号通路上的蛋白倾向发生 LLPS ，图 1a-b 。为评估蛋白 LLPS 功能，作者采用 optoDroplet 系统，将目标蛋白与绿色荧光蛋白 GFP 及 Cry2PHP 结构域，实现活细胞中靶蛋白的蓝光激发相分离。基于此技术，作者测试多种胰岛素信号通路蛋白的相分离现象，并证明这些蛋白易于聚集成液滴，在液滴流动性研究中使用荧光恢复（ FRAP ）技术光漂液滴中的荧光信号，液滴内部荧光可以实现自主恢复，证明这些液滴中的蛋白质是具有流动性并积极参与物质交换与信号转导，图 1c-e 。

Fig. 1 LLPS potential of insulin-related proteins.

胰岛素信号蛋白 LLPS 体外验证：

由于光敏的 Cry2PHR 在蓝光照射下可能发生自结合，因此 optoDroplet 系统被认为可能人为干扰细胞内部蛋白质相互作用而发生 LLPS 现象，于是作者在体外验证胰岛素信号蛋白 LLPS 现象。作者将目标蛋白包括 IRS1 、 GSK3 β 、 BAD 和 p27 等与 His-GFP 蛋白融合并在 E. coli 体系中过表达。纯化后的蛋白将在加入 PEG8000 后研究 LLPS 现象，实验中也发现不加入 PEG8000 的融合蛋白均未发生 LLPS 现象，而在加入 PEG8000 后在短时间内即发生液滴聚集现象，在布朗运动作用下持续运动，并受 NaCl 浓度调控， 6 图 2a-b 。

作者将 IRS1 的质粒序列编辑为三段， M1-S600 、 N601-T930 、 G931- 末端，并融合 His-GFP 双标签，只有 IRS1 ^M1-S600 的截断体表现出弱液滴聚集现象。这段序列区域在 1-259aa 存在一个 PH 同源结构域和 PTB 结构域， IDRs 则在 243-600aa ，图 2a-c 。

Fig. 2 Validation of LLPS proteins of insulin signaling in vitro.

细胞内 IRS1 液滴自发形成：

作者构建 GFP 和 IRS1 的融合质粒并在细胞内部过表达，实验中发现 cDNA 低浓度转染时液滴弥散在细胞内部并体积小， cDNA 高浓度转染时发现液滴聚集明显且体积明显大，这种浓度依赖性的调控与 IRS1 的酪氨酸磷酸化无关，图 3a-c 。聚焦 IRS1 液滴的研究发现，这些液滴是实心的立体空间三维结构，并且在 FRAP 测试下证明这些液滴是具有内部流动性并发生物质交换的动态体系，图 3d-g 。 IRS1 液滴给予 1,6- 己二醇（一种 LLPS 凝聚物溶剂）发生凝聚物溶解现象，这也证明 IRS1 是生物凝聚物的特性，图 3h 。

Fig. 3 Concentration-dependent formation of IRS1-GFP condensates in cells.

胰岛素调节 IRS1 液滴动态行为：

在 U2OS 细胞中转染低浓度 IRS1-GFP 质粒，起初并未发现明显液滴聚集现象，在给予胰岛素 30min 后发现细胞中出现明显液滴，认为胰岛素能够动态调控 IRS1 行为，图 4a 。内源性 IRS1 液滴主要发生在胞质而外源性转染的 IRS1 则有一部分发生在核内，在胰岛素刺激后 L6 肌细胞胞质中液滴增加，这说明胰岛素促进内源性 IRS1 发生相变。上述结果表明胰岛素能够调节 IRS1 液滴的动态行为。

棕榈酸酯能够通过 IRS1-PI3K-PK8 途径抑制胰岛素信号的转导，而在多种细胞中诱导胰岛素抵抗现象。当给予棕榈酸酯预处理后，胰岛素无法诱导 IRS1 发生液滴聚集，然后再给棕榈酸酯的抑制剂，又再次出现 IRS1 的液滴，图 4f-i 。

Fig. 4 Insulin regulates dynamics of IRS1 condensates in cells.

IRS1 凝聚物是介导胰岛素信号传导的功能枢纽：

LLPS 形成的蛋白质凝聚物可以招募相关因子富集，从而提高酶促反应速率，于是作者猜测在胰岛素刺激下， IRS1 可通过磷酸化酪氨酸残基与 PIK3 的 p85 亚基相互作用，实验中发现 p85-mCherry 与 GFP 共表达时可见弥漫性表达，图 5a 。并在实验中可以观察到 p85 和 p110 与 IRS1-GFP 共定位表达并不受胰岛素调控，图 5b-c 。 p85-p110 催化 [PI(4,5)P2] 产生 PIP3 受胰岛素刺激调控，不随 IRS1 聚集而发生，此外单细胞追踪实验也显示胰岛素诱导新生的 IRS1-GFP 凝聚物也能产生 PIP3 ，图 5g-6a 。 PDK1 和 mTORC2 作为下游 PKB 最重要的两个激酶在实验中发现， PKB β-mCherry 不与 IRS1-GFP 共定位二是受胰岛素调控被招募到 IRS1 液滴中发挥调控，这说明 PKB β 是在质膜上发挥作用。以上数据证明 IRS1 凝聚物可能是细胞内胰岛素信号转导的重要枢纽。

Fig. 5 Recruitment of signaling molecules and PIP3 production in IRS1-GFP condensates.

Fig. 6 IRS1 condensates produced PIP3 and recruited PKB in response to insulin.

PH-PTB 结构域在 IRS1 凝聚体中招募 PIP2 生成 PIP3 ：

作者希望明确为什么胰岛素信号相关组分能够自发形成液滴，实验中发现 p85-mCherry 在 IRS1 与突变体 IRS1Y/F 中均存在，这说明 p85-mCherry 的招募不依赖于 IRS1 酪氨酸磷酸化，其他胰岛素信号相关蛋白同样如此，图 7a 。值得注意得是，胰岛素不能刺激 IRS18Y/F-GFP 凝聚体中 PIP3 产生，这与野生型的 IRS1-GFP 结果截然不同，图 7b,5g 。这说明 IRS1 磷酸化不是招募 p85 进入 IRS1 凝聚体的关键，却是 p85/p110 二聚体激活的必要条件。

IRS1 的 PH-PTB 结构域能够结合 PIP2 ，作者认为这可能是 PIP2 的来源所在，于是构建 IRS1- Δ (PH -PTB) 突变体，删除了这段结构域。这个突变体仍能够自发生成液滴并招募 p85 但不能招募 PIP2 ，也不能招募 PIP2 的感受器 PDK1 与 SIN1 ，即便是胰岛素刺激仍然不能诱导突变体液滴中出现 PIP3 ，图 7a-c 。由此认为 IRS1 中 PH-PTB 结构域是招募 PIP2 、 PKD1 与 PIP3 的重要条件， PI3K 是生成 PIP3 的主要底物来源。

Fig. 7 Recruitment of signaling molecules and PIP3 production in mutant IRS1 condensates.