导师暴走！竟拿出祖传 IP/CoIP 实验 protocol，附异常条带分析
导师暴走！竟拿出祖传 IP/CoIP 实验 protocol，附异常条带分析
ShengWuXueBa
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上周组会，做了两个月 CoIP 的师弟居然没 data！不是 Input 泳道丢了，就是 IP 组没了目的条带？导师一脸黑线，准备亲自下海教学。
基础原理我真的明白！ IP 可以实现目的蛋白的纯化和富集；CoIP 则可以进一步研究蛋白之间的相互作用机制 。可是一设置实验组我就开始懵。
为证明实验结果的真实性和可靠性，在 CoIP-WB实验中一般需设置以下 5 个实验对照组 。
Input：阳性对照组，组织细胞裂解液，在做 IP 实验之前，需要先跑 WB，确认样本中含有蛋白 A 和蛋白 B；
IgG：阴性对照组，Anti-X 的同型对照抗体，如 Anti-X 是兔 IgG 型，则同型对照抗体需要选择 Rabbit IgG ；
IP：实验组，免疫沉淀（ immunoprecipitati on ），富集目的蛋白；
Anti-X：X 蛋白的免疫共沉淀抗体；
IB：免疫印迹（ immunoblotting ），用于显示目的蛋白。
实验 protocol 和常见 QA 我硬盘里应该存了一份，发你看看。
导师亲传
CoIP 实验 Protocol
IP 和 CoIP 实验的流程大致相同，主要包括样品的准备、免疫沉淀、洗涤、洗脱和下游分析。 具体步骤如下：
目前 IP 沉淀方式主要有三种：
在 IP/CoIP 实验中常见的两种 Beads 分别为琼脂糖珠和磁珠：
常见 QA 合集
实验难题一次解决
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1.
蛋白大小与轻重链相近或相同，无法区分？
原因： IP 变性洗脱时，抗体在高温和还原剂的作用下，会变性形成轻链和重链。
改进： 换用 IP/CoIP 专用的构象二抗（仅识别目的蛋白，不识别轻重链）如 Vazyme #RA1008 和 RA1009； 在 IP 和 WB 时，使用不同种属的一抗 （需要购买两种抗体）； WB 用直标一抗 （无二抗信号放大，可能产生信号弱或曝不出的情况）。
2.
Input 泳道无目的条带，IP 组有目的条带？
原因： 目的蛋白丰度不够或降解，Input 组检测不到，IP 组富集能检测到；
改进： 可以做常规 WB 验证，样本处理时添加蛋白酶抑制剂，提高 Input 组上样量。
3.
Input 泳道有目的条带，IP 无信号或目的条带弱？
原因： 样本抗原量少，不足以被检测到；抗体无法结合抗原；抗体亲和力差；IP 抗体未与磁珠结合。
改进： 用 IP 级别的抗体 ，一般而言，相比于 WB，IP 实验需要更高亲和力的抗体；抗体浓度太低，目的蛋白富集少，无法检测到， 选用浓度较高的抗体或增加抗体使用量 ；增加抗体与磁珠 孵育时间 ；正确保存防止磁珠变质或干燥。
4.
Input 泳道无目的条带，IP 无信号？
原因： 样本降解；样本蛋白丰度低
改进： 冰上操作，裂解样本时，加入蛋白酶抑制剂；样本蛋白丰度低，检测不到；提高样本量。
5.
IP 背景高或者出现非特异性信号？
原因： Beads 非特异性结合；非特异性蛋白与 Beads 结合导致背景高；抗体浓度过高或特异性不好；样本降解；
改进： ProteinA/G 与 Beads 结合导致背景高；使用前 使用 1～5% 的 BSA 进行预封闭 、免疫沉淀后增加漂洗次数和盐离子浓度；或选用特异性更好、效价更高的 Beads，如 Vazyme#PB101（ChIP 级磁珠）；选用合适抗体类型和使用浓度；裂解样本时 加入蛋白酶抑制剂或新鲜制备样本 ；投入合适的样本量，样本过多可导致背景高。
6.
相互作用蛋白信号弱？
原因： 表达量过低；目的蛋白识别表位被互作蛋白所遮盖；在洗涤过程中丢失。
改进： 做 WB 先验证蛋白表达量，提高上样量或使用互作蛋白含量高的样本进行实验；选择高亲和力的抗体（IP 级别抗体）；实验开始前确定 合适的去垢剂和盐离子浓度 ，防止在洗涤中丢失。
要想实验不白做，选好工具是关键！
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内容策划：王丹琦 内容审核：吴军
题图及文中图片来源：诺唯赞