ACS Chem. Biol. | G-四链体结构作为开关可调控铁死亡

非经典的G4 DNA结构通过富含鸟嘌呤的DNA中鸟嘌呤Hoogsteen 氢键生成，多数位于启动子中且可调控转录。Pyridostatin（PDS）已知可以稳定DNA G4，在这里被用于提高G4的水平。未被刺激的细胞在低浓度PDS预处理条件下存活率未被明显影响，但在erastin刺激下PDS的预处理可以显著提高细胞存活率。同时erastin促进的铁死亡中不稳定铁池（LIP）, 脂质氧化物以及丙二醛（MDA）的上调均可被PDS条件所抑制，同时铁死亡中谷胱甘肽（GSH）水平的下调也有所回升。（图 2）。

在展示G4可抑制铁死亡后，作者进一步研究G4对ATF4水平的影响。在ATF4转录起始位点（TSS）的上游启动子区域发现GC含量较高，且GC含量随着离TSS距离的缩短而上升，说明有生成G4结构的可能。在PDS的预处理下，HepG2 中ATF4的mRNA以及蛋白水在erastin条件下的上升被抑制，说明PDS可通过稳定G4结构降低铁死亡中ATF4的上调。（图 3）。

为了证明G4结构的存在，作者对比ATF4启动子中富含G的序列（WT）以及突变体（Mut5），通过圆二色性与细胞内免疫荧光发现只有在胞质中的WT而非Mut5可形成G4结构，且结果与正对照寡核苷酸相似，证明此富含G的序列可以形成G4。（图 4）。ChIP-qPCR检测到细胞内G4结构在加入erastin后明显减少，说明erastin可以破坏细胞內源的G4结构。

对比转染进的WT可抑制细胞中erastin引发的ATF4上升，Mut5因丢失G4结构而失去了调节ATF4 mRNA水平的功能，不能降低铁死亡中ATF4水平的上调。（图5）。作者推测erastin未对WT造成影响的原因是erastin优先破环了被转染进的G4结构，使得更少的erastin可以与内源的G4作用并阻碍其功能，所以ATF4 mRNA水平变化不明显。带有WT或Mut5启动子的荧光素酶报告基因在细胞中表达，erastin处理后WT组的荧光信号明显减弱，而Mut5的荧光信号与对照组相似，进一步验证了ATF4启动子中G4对ATF4起到调控作用。

综上所述，作者通过增加G结构稳定性发现erastin激活的铁死亡现象降低，且ATF4 mRNA以及蛋白水平的上升被抑制，同时证明了ATF4启动子富含G的区域可生成G结构。本文首次报道了G4结构对ATF4以及铁死亡现象的调控，对未来通过调控铁死亡以及相关基因从而引发肿瘤细胞的死亡提供了帮助。