研究控制转子荧光团的灵敏度！
研究控制转子荧光团的灵敏度！
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基于分子转子的荧光团（RBFs）会在微观粘度增加时激活荧光，因此在许多领域都有广泛的应用前景。然而，如何控制 RBFs 的荧光对粘度变化的响应仍是一项挑战。
鉴于此，近期由中国科学院大连化学物理研究所刘宇、南京师范大学黄鹤、西湖大学和杭州西湖生命科学与生物医学实验室张欣等研究人员合作在《Aggregate》上发表了相关成果。该研究利用氢键调节rbf对黏度的敏感性。研究发现，分子内氢键增加了旋转势垒，从而改变了多个RBF探针的粘度灵敏度。
研究概述
该研究证明了激发态 RBFs 分子内氢键的形成和调节可以调节其旋转障碍，从而合理控制微粘度如何激活其荧光。基于这一策略，开发出了一系列基于 4-hydroxybenzylidene-imidazolinone (HBI) 的 RBF，这些 RBF 的粘度灵敏度范围很广。结合之前报道的 AggTag 方法，这些探针的不同粘度灵敏度和发射光谱实现了双色成像策略，在活细胞中蛋白质的多步聚集过程中同时检测蛋白质寡聚体和聚集体。总之，研究表明，在 RBF 上安装细胞内激发态氢键可以合理控制旋转障碍，从而对其粘度灵敏度进行微调。除了 RBFs 之外，还设想可以采用类似的策略来控制一大批荧光团的致荧光行为，这些荧光团的发射依赖于激发态旋转运动，包括聚集诱导发射荧光团。
图文导读
基于分子转子的荧光团（RBFs）是一类新兴的荧光分子，它们在激发态下沿着特定的键旋转以调节其荧光特性。旋转运动会影响荧光团的电子特性，从而导致发射效率发生变化。在低粘度溶剂中，RBFs 会发生旋转并经历扭曲的分子内电荷转移（TICT）过程，在激发态迅速发生分子内电荷转移，从而有效地淬灭荧光发射。当 RBFs 埋藏在粘性环境中时，TICT 过程会受到抑制，从而导致荧光增强（图 1A）。因此，RBFs 的一个共同特点是对粘性敏感，这使它们能够广泛应用于蛋白质构象变化或膜动力学等生物过程。然而，如何控制 RBFs 的荧光对粘性变化的响应方式仍然是一个挑战，从而限制了一大类 RBFs 的应用和应用范围。因此，开发多种化学原理以合理控制 RBFs 各种支架的粘度敏感性是非常可取的。 控制粘度灵敏度的关键是调节激发态下沿旋转基团的旋转势垒。 在过去的几年中，研究团队已经报道了两种策略，即利用π电子密度或富π碳-碳键来影响粘度敏感性。 例如，发现电子密度调节器(EDR)可以合理地控制4-羟基苄基-咪唑啉酮(HBI)的激发态旋转势垒。 EDR的π电子可以与荧光团共轭并调节旋转i键的σ与π分量(图1B)，从而改变HBI的激发态旋转势垒和粘度敏感性。 然而，这种方法大多局限于HBI的调节，对其他RBF支架具有挑战性。 在另一项工作中，报道了富π碳碳键的安装作为调节rbf多个支架旋转屏障的一般策略。 不幸的是，富π连接体的扩展将不可避免地导致激发和发射光谱的红移。 因此，引入新的化学策略，既能控制多种RBF支架的粘度敏感性，又能最小程度地干扰其光谱特征，将是有益的。
在这项工作中，报道了在激发态安装氢键(h键)来调节rbf的粘度敏感性。以HBI为例，发现苯环邻位的分子内氢键(图1B)可以有效地调节HBI的激发态旋转势垒(Ea)，从而控制粘度敏感性(图1B)。结果表明，分子内氢键主要增加Ea，其值与氢键强度呈正相关。除HBI外，还展示了该策略对其他RBF支架的有效性，从而验证了该策略的普遍性。此外，分子内氢键可以与其他机制共同作用，产生协同效应来调节rbf的黏度敏感性。最后，应用基于hbi的分子内氢键探针来观察体外和活细胞中的多步骤蛋白质聚集过程。总之，这项工作提供了另一种通用策略来调节rbf的粘度敏感性，通过调节激发态旋转势垒和最小程度地干扰发射光谱特征。引入分子内氢键可以潜在地应用于其他分子激发态，以化学控制所需的性质。
图1：合理调控转子基荧光团（RBF）的激发态旋转势垒，控制其粘度敏感性。
BI的荧光发射受扭曲分子内电荷转移(TICT)过程控制，在激发态沿I键旋转导致非辐射衰变。然后，假设在HBI上安装不同强度的氢键会调节其旋转运动，从而导致粘度敏感性的变化。为此，分别合成了具有O−H··、N−H··N和O−H··N等不同类型分子内氢键的HBI和三个衍生物(图2A )。随后，使用不同比例的乙二醇和甘油混合物，测量了化合物1a-1d在不同粘度溶剂中的荧光强度。将荧光强度的对数作为溶剂粘度对数的函数拟合图的斜率定义为粘度敏感性值(x)，在1a-1d范围内分别确定为0.67、0.43、0.42和0.33(图2B-C)。这些结果表明，分子内氢键影响了hbi基rbf的粘度敏感性。x值从1a到1d的减小可以归因于激发态旋转势垒的增加。为了验证这一概念，进行了密度泛函理论(DFT)计算，以确定基态(S0)和第一激发单重态(S1)的势能面(PES)。在计算中，将φ角定义为苯基沿I键旋转的二面角(图1B)。对于x值最大的1a，发现它的S1激发态旋转势垒(Ea)为0.05 eV(图2C,D)。然而，x值最小的1d表现出更高的势垒，为0.23 eV(图2C和2E)。在它们的TICT态(φ = 90°)下，S1和S0态之间的能隙(ETICT)在1a和1d中分别为0.3698 eV和0.6469 eV(图2D-E)。对于中等x值的1b和1c，确定其旋转势垒分别为0.0857 eV和0.097 eV(图2B)。HBI衍生物的Ea值与其x值呈负相关(图2B)，表明较高的旋转势垒对应较低的x值(即在较低粘度下容易激活荧光)。因此，光激发1d将经历更大的Ea，通过更大的ETICT进行非辐射衰变，即使在较低的粘度下也会产生荧光发射。相比之下，1a会在较小的Ea上旋转并进入TICT状态，通过较小的ETICT进行非辐射衰变。这些结果共同表明，分子内氢键的引入有效地限制了I键的旋转，导致HBI在激发态具有更高的旋转势垒，降低了HBI的粘度敏感性。
图2：安装分子内H键以调节激发态HBI衍生物的势能面（PES）。
接下来，研究了1b到1d在基态(S0)和激发态(S1)下的分子内氢键。还原密度梯度(RDG)分析表明，1b-c在基态和激发态都存在氢键(图3A)。在S0状态下，1b、1c和1d的氢键能分别为- 7.61、- 9.11和- 15.43 kcal/mol(图3B)。在S1态，1b、1c和1d的氢键能分别为- 8.38、- 9.70和- 15.74 kcal/mol(图3B)。在每种化合物的S1态，氢键强度的增加对应于旋转势垒的增加和x值的减小(图2B)。此外，所有化合物的激发态氢键强度都比基态氢键强，这表明分子内氢键会更有效地影响激发态下沿I键的旋转运动。氢键可以诱导激发态分子内质子转移(ESIPT)。[23,24]为了排除这种可能性，我们计算了ESIPT过程的吉布斯自由能(ΔG)，负的ΔG有利于吉布斯自由能，正的ΔG不利于吉布斯自由能。对于1b和1c，通过计算无法识别ESIPT产品。对于氢键最强的1d，虽然ΔG为18.04 kJ/mol，但可以形成ESIPT的产物(图3C)，这表明ESIPT过程在热力学上是不利的。这些结果有力地表明，激发态增强的分子内氢键在调节HBI衍生物的激发态旋转势垒和粘度敏感性方面起着重要作用。
图3：H键能量和激发态分子内质子转移（ESIPT）过程的计算分析。
然后，询问其他rbf的粘度敏感性是否会受到分子内氢键的安装的影响。为此，选择了两个具有代表性的rbf, 2-(恶唑-萘噻唑-吡啶-2-基)苯酚(IP1, 2a)和2-(4-氨基苯基)苯并噻唑(p-APBT, 3a)。分子内氢键是通过在苯基取代基的邻位上引入羟基来实现的，提供2b和3b(图4A)。对于两种rbf支架，具有分子内氢键的探针显示出x值(2b为0.076,3b为0.032;图4B)，明显小于没有氢键的对应(2a为0.18,3a为0.13;图4B)。x值的变化表明，具有氢键的rbf具有较高的激发态旋转势垒，从而导致x值较低。综上所述，研究结果提供了令人信服的证据，表明分子内氢键的安装可以作为合理控制基于多种支架的rbf粘度敏感性的一般策略。
图4：安装分子内H键是使用多个支架和RBF基光敏剂调节转子基荧光团（RBF）粘度灵敏度的一般策略。
研究选择化合物1d作为起点，用吲哚将π共轭扩展到二乙烯基，得到化合物4a(图5A)。在前人的基础上，将二乙烯基命名为电子密度调节剂(EDR)，其π电子密度应与旋转活化能(Ea)呈正相关，并控制粘度敏感性。据此，确定4a的x值为0.26(图5B)，略小于1d。这一观察结果与共轭π轨道抵抗旋转的机制一致，因此吲哚基团会导致更高的旋转势垒和更低的x值。为了支持这一观点，理论计算确定S1激发态的旋转势垒(Ea)为0.51 eV(图5C)，比1a的势垒(0.23 eV)高出约两倍(图2E)。当吲哚基团被π电子密度降低的杂环取代时(图5A中的化合物4b至4f)，观察到x值增加，吡咯为0.33，噻唑为0.35(图5B)。这些结果共同表明，分子内氢键的安装可以与其他机制共同用于调节rbf的粘度敏感性。最后，探索了这些探针在不同介质常数下的荧光响应，结果表明，包括探针P1和P2在内的所有化合物都表现出无溶剂敏感性，并且对极性、氢键等具有出色的抗干扰能力。所有化合物的合成方法可在辅助资料中找到。
图5：结合分子内H键和电子密度调节剂（EDR）协同控制粘度敏感性。
综上所述，研究已经证明，分子内H键的安装是控制RBF粘度敏感性的一般策略。虽然H键可以在基态（S0），研究表明它们的强度在单重态激发态（S1).由于这些H键的结构会中断光激发荧光团的旋转，具有分子内H键的RBF在平面荧光结构和暗扭曲构象之间表现出更高的激发态旋转势垒。由于较高的旋转势垒，具有分子内H键的RBF以较低的粘度发出荧光，这反映在它们的x值比没有H键的对应物小。在这项工作中，研究应用这种策略来控制三类RBF的粘度灵敏度，导致x值的范围从0.04到0.67。除了这种方法之外，研究还表明它可以与其他化学策略联合使用，以协同控制RBF的粘度敏感性。作为一种应用，基于HBI支架的RBFs允许进行双色成像实验，以可视化体外和活细胞中的多步蛋白质聚集过程。综上所述，该研究增加了一种新的化学机理来合理控制粘度敏感性RBF。设计具有所需激发态旋转屏障的荧光团的能力为社区提供了增强生物和材料科学新应用的机会。
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