Nat Commun|DIA 蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学常用软件和分析工作流程的基准测试

研究人员 制备了小鼠脑膜蛋白，以规定的比例掺入酵母蛋白质组背景中（图 1a ）。每个基准样品都在五个过程重复 中 制备， DIA 模式下的 QE HF 和 diaPASEF 模式下的 timsTOF Pro （图 1a ）。 同时， 构建了三类库以使用每种软件工具进行测试（图 1b ）。使用 FragPipe 从原始 DDA 数据生成通用库 。通过四种软件工具对通用库进行的数据分析建立了相同的评估基线。 Spectronaut 、 MaxDIA 和 Skyline 允许使用集成搜索引擎处理 DDA 数据，以生成特定于软件的 DDA 库。总的来说，利用四个软件与七个光谱库（一个通用库、三个特定软件的 DDA 依赖库和三个 DDA 独立库）相结合，从而产生 10 种不同的数据分析工作流程（图 1b ）。

使用  DIA-NN 、 Spectronaut 、 MaxDIA 和 Skyline （均为最新版本）来处理 HF 数据集。借助通用文库， DIA-NN 、 Skyline 和 Spectronaut 产生了小鼠膜蛋白质组（ 4919-5173 种蛋白质），但 Skyline 的 FDR 控制不足。借助特定于软件的 DDA 依赖库， Spectronaut 报告 5354 种小鼠蛋白质和 67,310 种肽获得了最高的覆盖率（图 2a ）。当使用计算机库时， DIA-NN 通过报告 5186 种小鼠蛋白质和 51,313 种肽实现了最佳识别性能（图 2a ）。计算机库的 DIA-NN 覆盖了通用文库本身鉴定的 94.3% 的蛋白质。 DIA-NN 、 Spectronaut 和 MaxDIA 获得了类似数量的每种蛋白质的肽，但密度图偏向 Skyline 的下端， Skyline 报告的肽鉴定最少（图 2b ）。

研究人员 生成了一个预测的诱饵库，该库基于先前从拟南芥蛋白质组中鉴定的肽 肽段 。将这个诱饵库的增量部分（ 10% 、 20% 、 50% 和 100% ）附加到通用库中以创建一系列目标诱饵库，不仅可以评估 FDR ，还可以评估假阴性率 (FNR) 蛋白质组学鉴定。

为了在细胞信号研究中评估 DIA-NN 和 Spectronaut ， 研究人员 进行了 TNF-α 诱导的磷酸化蛋白质组学实验，其中在不存在或存在 I-kappa-B 激酶抑制剂 TPCA 的情况下用 TNF-α 刺激 MCF-7 细胞 -1 （图 5a ）。然后，在 QE HF-X 和 timsTOF Pro 仪器上获取每个重复的 DIA 和 DDA 数据。 DIA 数据集由两个软件工具处理，使用项目特定的 DDA 库或独立于 DDA 的库（图 5a ）。

研究人员对 DIA 系统全面性的评估提示在进行 DIA 数据分析时 DIA-NN 和 Spectronaut 表现尤为出色。 蛋白质组学基准数据分析中， Spectronaut 使用通用或 DDA 依赖库的蛋白质鉴定略多，但 同样  DIA-NN 使用 DDA 独立库产生了更高的蛋白质组覆盖率。此外， DIA-NN 在 FDR/FNR 控制、量化准确性和精确度以及 DEP 检测的灵敏度和特异性方面比 Spectronaut 表现更好。