药物研究中方法验证与方法确认的区别及联系
药物研究中方法验证与方法确认的区别及联系
PREP_2019
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来源：北京药研汇
无论什么方法，在使用之初，一般在下列情况下，要求对分析方法进行验证、确认（或称证实）或重新验证。那么，方法验证和确认究竟有什么区别及联系呢？相信很多小伙伴都都是不了解的，即使了解也不能准确的给出具体的答案。不知道的小伙伴有福了，今天咱们就来具体的说说。
任何分析检测的目的都是为了获得稳定、可靠和准确的数据，方法验证在其中起着极为重要的作用。方法验证的结果可以用于判断分析结果的质量、可靠性和一致性，这是所有质量管理体系不可分割的一部分。
一般在下列情况下，要求对分析方法进行验证、确认（或称证实）或重新验证：
（1）首次用于常规检测前；
（2）转到另一个实验室时；
（3）对于验证过的方法，其条件或方法参数发生变化时（例如，仪器性能参数发生改变或样品基质不同时），并且这种变化超出了方法的原适用范围。
对实验室有影响的法规和质量管理标准一般都要求进行方法验证。有的法规中直接使用“验证或确认”一词，并列出特定参数，也有的法规用这样的陈述暗示验证要求——“检测方法应适合于预期用途。”
国内主要法规标准
国内第三方检测机构一般均非标准制修订机构，方法验证或确认的来源基本来自资质认定或实验室认可的要求，主要依据如下：
01、CNAS-CL01:2006
方法选择：实验室制定的或采用的方法如能满足预期用途并经过确认，也可使用。所选用的方法应通知客户。在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准方法。如果标准方法发生了变化，应重新进行证实。
（1）实验室应对非标准方法、实验室设计（制定）的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行确认，以证实该方法适用于预期的用途。确认应尽可能全面，以满足预定用途或应用领域的需要。实验室应记录所获得的结果、使用的确认程序以及该方法是否适合预期用途的声明。
按预期用途进行评价所确认的方法得到的值的范围和准确度，应与客户的需求紧密相关。这些值诸如：结果的不确定度、检出限、方法的选择性、线性、重复性限和/或复现性限、抵御外来影响的稳健度和/或抵御来自样品（或测试物）基体干扰的交互灵敏度。
02、实验室资质认定评审准则
实验室应确认能否正确使用所选用的新方法。如果方法发生了变化，应重新进行确认。实验室应确保使用标准的最新有效版本。
实验室自行制订的非标方法，经确认后，可以作为资质认定项目，但仅限特定委托方的检测。
03、司法鉴定机构资质认定评审准则
司法鉴定机构应当证实能否正确使用所选用的标准方法。标准方法发生变化应当重新进行证实。
司法鉴定机构自行制订的非标准方法，经省级以上司法行政机关指定的组织确认后，可以作为资质认定项目。
04、CNAS-CL02:2013
检验程序的确认：实验室应对以下来源的检验程序进行确认：
a) 非标准方法；
b) 实验室设计或制定的方法；
c) 超出预定范围使用的标准方法；
d) 修改过的确认方法。方法确认应尽可能全面，并通过客观证据（以性能特征形式）证实满足检验预期用途的特定要求。
（注：检验程序的性能特征宜包括：测量正确度、测量准确度、测量精密度（含测量重复性和测量中间精密度）、测量不确定度、分析特异性（含干扰物）、分析灵敏度、检出限和定量限、测量区间、诊断特异性和诊断灵敏度。）
05、CNAS-CL08:2013
鉴定机构应对非标准方法进行确认以证实该方法适用于预期的用途，并保存使用的确认程序、所获得的结果、以及该方法是否满足预期鉴定目的的评价等记录。
按预期用途对鉴定方法进行确认时，鉴定机构应有证据证明对影响结果的因素进行了评价。所确认的鉴定方法的值范围和准确度应与客户的需求紧密相关。
诸如：结果的不确定度、检出限、方法的选择性、线性、重复性限和/或复现性限、抵御外来影响的稳健度和/或抵御来自检材/样本基体干扰的交互灵敏度。
06、其他
CNAS-CL52:2014《CNAS-CL01<检测和校准实验室能力认可准则>应用要求》：在引入检测或校准方法之前，实验室应对其能否正确运用这些标准方法的能力进行验证，验证不仅需要识别相应的人员、设施和环境、设备等，还应通过试验证明结果的准确性和可靠性，如精密度、线性范围、检出限和定量限等方法特性指标，必要时应进行实验室间比对。
CNAS-CL10:2012《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》：
方法的选择：实验室应对首次采用的检测方法进行技术能力的验证，如检出限、回收率、正确度和精密度等。如果在验证过程中发现标准方法中未能详述但影响检测结果的环节，应将详细操作步骤编制成作业指导书，作为标准方法的补充。当检测标准发生变更涉及到检测方法原理、仪器设施、操作方法时，需要通过技术验证重新证明正确运用新标准的能力。
方法确认：a) 任何对标准方法的偏离，都必须进行实验室确认，即使所采用的替代技术可能具有更好的分析性能。b) 实验室应通过试验方法的检出限、精密度、回收率、适用的浓度范围和样品基体等特性来对检测方法进行确认。
CNAS-CL09:2013要求：标准方法引入检测之前，实验室应证实能够正确地运用这些方法，并未清晰说明如何证实，而对非标方法的确认提供的参考资料，比如SN/T 3266-2012《食品微生物检验方法确认技术规范》；CNAS-CL18:2013规定标准方法必要时才进行技术验证；CNAS-CL44:2013和CNAS-CL56:2014仅规定非标准方法（包括实验室自制定方法）才需要确认；CNAS-CL55:2014仅规定：以软件方式、物理方式或采样方式等标准未明确的方法进行低辐照度试验时，实验室应对该方法进行确认。
除化学领域明确规定应对标准方法进行确认或验证外，其他领域仅要求对非标方法进行确认或验证，或者未做规定，而且对确认和验证是否有区别也未作说明。但是CNAS-CL52:2014是与CNAS-CL01:2006同步应用的，具有等同效力，因此其他领域如未对标准方法确认或验证进行规定的，应参考CNAS-CL52执行。
国外主要法规标准
01、美国FDA
cGMP（药品动态生产质量管理规范）和GLP（临床前研究实验室质量管理规范）等法规要求必须进分析方法的验证。美国cGMPs 提出了验证要求：
（1）应用检测方法时，应建立并记录准确度、灵敏度、专属性以及重现性；
（2）实验室的记录应包含用于样品检测的每个方法的声明。声明中应指明建立方法的数据位置，这些数据应能证明该检测方法在应用于产品检测时符合特定的准确度和可靠性标准要求。所有检测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实；
（3）如对应用于检测的已确认方法有任何变更，应保存完整的变更记录。该记录中应包含变更原因以及相关数据，以证实方法变更后的样品检测结果至少能达到原方法相同的准确度和可靠性；
FDA GLP 法规21 CFR 第58 部分并未用到“验证”一词，但是依据58.113 中的要求，检查员需要检查验证研究记录：“应采用合适的分析方法进行检测”，其中“合适的”即意味着验证。并且FDA 的生物分析方法验证指南中规定临床前毒理研究也属于验证范围；
FDA 关于生物利用度和生物等效性要求的法规21 CFR 320第29节中规定：用于体内生物利用度研究以检测体液或排泄物中活性药物成分或治疗成分检测的分析方法，或用于急性药理作用检测的方法，应证明其具有准确性和足够的灵敏度以及恰当的精密度，能满足体内的活性药物成分/治疗成分或其代谢产物的实际浓度的检测要求。
02、(PIC/S)
药品检查协定和药品监察检查合作计划PIC/S 的使命是“领导制定、实施和维护国际性的、统一的药品生产质量管理规范（GMP）标准以及药品领域检查工作质量体系”。
这一使命通过以下手段得以实施：制定和推广统一的GMP 标准和指导文件；培训主管部门、尤其是检查员；评审检查活动；以及促进主管部门和国际组织的合作和网络化。目前，约有50个政府组织参加了PIC/S，包话所有的欧盟成员国。许多新的成员国还没有按照PIC/S GMPs建立自己的GMP 法规。
PIC/S 的GMP 与欧盟的GMP 指令非常相似。两个文件都在第6.1.5 部分以相同的文字规定了分析方法验证的要求：分析方法应经过验证。申请上市许可的所有检测均应按照批准的方法进行。
在PIC/S 的实验室现场检查指南中包含检查员检查质量控制实验室时的一些提问。这些问题包括：
方法验证是不是验证总体计划的一部分？
有没有通用的方法验证SOP？
方法验证报告是否经过正式批准？
是否明确验证目的？
是否按ICH规定的参数对每一种方法进行完整的验证并记录？
是否规定了每种方法的接受限度并能符合该限度规定？
03、国际协调会议（ICH）
国际协调会议（ICH）发起于1990 年，汇集了欧盟、日本和美国的监管机构和这三个地区的制药行业专家，一起讨论产品注册方面的科学和技术问题。
ICH 出版的指导原则，有些被成员国（如欧盟）写入法律，有些被国家权力机构（如美国FDA）推荐为指南。其中，最为重要的ICH 文件是活性药物成分的GMP 指南。在第12章中规定了方法验证的要求：应对分析方法进行验证，所用方法收载于相关的药典或其他认可的标准参考文件中的除外。所有检测方法均应在实际使用条件下证实其适用性；实施分析验证的程度应能反映分析的目的以及活性药物成分的生产工艺状况；开始验证分析方法前，应考虑对分析设备进行适当的确认。
04、美国药典（USP）
美国药典（USP）为具体的应用制定方法，并针对FDA 监管的行业内不同的分析特点制定通则。根据联邦食品药品和化妆品法案501 部分的规定，USP 方法构成法定标准。USP 制定了两个与方法验证有关的通则。
通则<1225>是“法定方法的验证”。该通则中给出了用于新方法验证的各种参数。通则中的建议可以被药品实验室用作自行制定方法的验证。
通则<1226>是“法定方法的确认”。该通则用于实施药典和标准方法的实验室。这些内容也适用于实验室应用其他实验室验证过的方法。
05、ISO/IEC 17025
同CNAS-CL01:2006《检测和校准实验室能力认可准则》，以上国内外法规标准中多次出现验证、确认和证实三个术语，由于国内翻译问题，经常在标准中将确认和验证混用或等同。正确的翻译：Verification译成确认或证实，Validation译成验证，建议参考美国USP。
导致很多实验室认为方法确认或验证困难重重原因有四：
（1）法规标准的翻译问题，导致理解存在偏差，比如CNAS-CL01:2006中5.4.2所描述的“证实”即与“确认”同义；
（2）部分法规标准未作详细说明，比如《实验室资质认定评审准则》；
（3）方法确认和方法验证定义不清，概念搞混；
（4）国人缺乏研究心态，有点困难就逃避，懒惰之心严重。
验证和确认的定义
01、方法验证（Validation of method）
USP：方法验证是一个通过实验室研究来证明程序的性能参数符合期望的分析应用要求的过程。
ICH：分析方法验证的目的是显示分析方法适用于它所期望的应用目的。
FDA：方法验证是一个阐述分析方法适合于其使用目的的过程。
02、方法确认（Verification of method）
USP<1225>：USP-NF所收载方法的使用者不需要验证这些方法的准确性和可靠性，但需要确认这些方法在实际使用条件下的适应性。
USP<1226>：确认包括所涉及方法的性能参数，如那些在<1225>中描述的，以建立恰当的、相应的数据，而不是重复验证的过程。
FDA：出现在USP中的方法被认为已验证，对于法定方法，厂家必须阐明该方法在实际使用情况下的状态。
总体来讲，方法验证是阐明方法适合于它使用目的的一个过程，方法确认是通过已验证的方法进行检测的条件确实适合于该已验证方法的过程。
方法验证参数和试验
01、方法验证的参数
USP<1225>规定实验室应采用试验方式进行方法验证：“应通过实验室的研究制定成一定的分析方法验证程序，证明方法的性能参数符合预期的分析应用要求。”不同国家和国际委员会的工作组都对方法验证所要求的试验作出了规定，这些在文献中都有阐述。不幸的是，一些定义在不同的组织间差异很大。为了达到标准化的目的，ICH 来自美国、欧洲和日本的行业和监管机构代表定义了分析方法验证的参数、要求和方法。
表1 典型化学分析方法验证参数的选择
表2 国内外对方法验证参数的要求
注：（1）依据GB/T 3358.2-2009《统计学词汇及符号第2部分：应用统计》（ IDT ISO3534-2:2006）和GB/T6379.1-2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义》（ IDT ISO5725-1:1994）中规定“准确度”的定义为正确度和精密度的组合，而国内目前部分标准中（包括上表）的“准确度”仅等同GB/T 3358.2-2009中的“正确度”，所以上表的准确度与正确度同义，此差异主要是由于国内标准制订引用术语不严谨造成。
（2）回收率是表示准确度/正确度的一项指标；
（3）再现性亦称复现性、重现性；
（4）由于重复性和再现性条件均为精密度的两种极端条件，因此引出中间精密度这一术语，具体定义见GB/T 3358.2-2009。
CNAS-CL01:2006和CNAS-CL10:2012对方法确认的具体参数描述已经与表1类似，但确认终究不是验证，因此一般要求对非标准方法参照表1进行验证，而标准方法的确认则适当采用简化程序。
至于每项参数的验证试验具体如何操作，可参考本文后的相关参考文献，这里不做过多阐述。
02、方法验证的步骤
某某个具体方法的有效性应通过实验加以证明，一般使用与常规分析的未知样品接近的样品或标准品进行验证试验。其准备和执行应按照验证计划进行，最好写成作业指导书。图1为方法验证的参考步骤。
图1 方法验证常规步骤
方法确认（证实）
ISO/IEC 17025 要求：“应优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法。”，这些标准方法被认为已经得到验证。因此，许多技术人员错误地认为标准方法不需要在实验室中做任何进一步的验证、证实或试验即可投入使用。
US FDA CGMP 法规在21 CFR 211.194 (a)(2)中规定：“如果应用的方法收载于现行的美国药典或其他认可的标准方法中，或在批准的新药应用中有详细方法且未改变这一参考方法时，有指明方法和参考文献的声明即满足要求。所有检测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实。”ISO/IEC 17025 在5.4.2 中有类似的要求：“在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准方法。如果标准方法发生了变化，应重新进行证实。”
这里明确了标准方法只要不发生变更，不需要进行验证，但实验室应确认其有能力成功运行该方法。当决定选择什么样的证实方式最好时，问题又来了。是否需要重做部分验证试验还是全部的验证试验都要重做，或者仅仅系统适用性试验或质控样品结果满意是否足够，这些都不清楚。
USP 在通则<1226>法定方法的确认中回答了这些问题，给出的建议适用于法定方法和标准方法的实施，关键的建议有：
1.通过系统适用性试验证明实验室和系统的性能
2.评价方法的临界性和复杂性
3.选择最重要的方法性能参数
4.根据方法的临界性和复杂性，重复1～3 个最为重要的验证试验
ISO/IEC 17025在5.4.5.2中也给出相应的注解：用于确定某方法性能的技术应当是下列之一，或是其组合：
1.使用参考标准或标准物质（参考物质）进行校准；
2.与其他方法所得的结果进行比较；
3.实验室间比对；
4.对影响结果的因素作系统性评审；
根据对方法的理论原理和实践经验的科学理解，对所得结果不确定度进行的评定。
与内部制定方法的验证相同，标准方法的确认和评价也应该遵循文件化的程序，如确认计划或作业指导书。法定/标准方法的确认过程见图2。
图2 方法确认的参考过程
那么，确认参数和试验该如何选择呢？参数和试验的选择与应用类型相关，图3为USP <1226>为特定应用推荐的确认试验。
图3 USP <1226>为药物分析推荐的确认试验
图4 AOAC 为特定的应用推荐的确认试验
相对于方法验证来说，方法确认类似于方法验证的简化版，且方式更灵活。但是实验室最终该如何做好方法验证或确认，还需要各实验室对相关法规标准及参考文献进行深入的研究，制定适合自身的作业指导书并严格执行，才能在应对认证认可和技术发展两个层面实现双提高。
最后，将方法验证、确认和转移简单总结如下：
表3 方法验证、确认和转移总结
【线上】质量体系及QA人员的要求
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主办单位
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中国化工企业管理协会医药化工委员会
北京华夏凯晟医药技术中心
各有关单位：
药品注册是药物研发、药物创新、药物改进和技术转移过程中不可逾越的关键环节，药品注册标准和监管水平直接影响着药物研发的素质和水平。而药品注册与技术评价工作涉及的政策性和技术性较强，是药品上市的关键，决定着申报药品的命运，对药物的研发及合规具有极强的诱导效应。医药生产企业、医药研发机构在政策合规下的注册体系管理方法和技巧，药品注册申报和技术审评等工作的合规及严谨，有助于提高药物创新改造升级水平和申报效率。
为此，我单位定于 2023年2月25日-26日 通过 线上直播 的方式举行 “2023药品注册事务体系构建及实战申报执行策略实操”高级研修班。 请各单位积极选派人员参加。
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会议安排
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会议地点：腾讯会议（具体账号通知给已报名人员）
议时间：2023年2月25日-26日
✦ 主讲老师介绍 ✦
张老师： 国内知名注册专家，国家局客座讲师。任职国际大型医药公司注册申报事务负责人。近二十年的国内外注册经验，对法规有深入的研究，多产品成功申报经验。数次参与CDE注册法规的讨论、制定。协会特聘专家。
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会议主要交流内容
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第一天 上午：9:00-12:00 下午：13:30-16:30
第一天：注册事务体系构建策略及实践应用
一、全球药物审评审批以及监管体系分析
1、中美欧监管体系分析
（1）监管体系的差异及其原因
（2）中美欧不同监管体系的优劣
（3）应对不同国家要求的策略分析和应对方法
（4）中外双报常见的问题概述
（5）接轨国际监管体系对药企注册事务带来的优势和挑战分析
2、ICH组织及其注册事务中职能介绍
（1）ICH的组织构架及职能变化
（2）ICH指导原则在国际注册中的作用
3、全球监管发展趋势分析及科学应用
（1）中美欧近期监管法规体系的变化异同分析
（2）目前行业与监管的争议以及合作现状
（3）国内外监管体系的发展趋势及其对注册事务的影响分析
（4）监管科学理论对于药品审评的作用
（5）监管科学理论在注册申报中的应用
二、药品注册知识管理体系详解及申报工作实践
1、中美欧法规构架及其体系介绍
（1）法规构架的依据以及特点
（2）目前药品法规构架的优势以及不足
（3）法规构架体系的缺陷对于药品注册的影响及其应对策略
2、注册事务知识体系的构建以及扩展
（1）注册人员的知识体系建立要求
（2）法规以及指导原则的搜索和应用
（3）如何将法规转化为助力产品开发的工具而非障碍
（4）技术文献以及审评报告的作用分析
（5）注册情报工作介绍
（6）竞争对手信息的搜索以及参考意义
3、注册策略制定流程及技巧
（1）什么是注册策略
（2）注册策略的重要性
（3）如何将策略与实际情况结合
（4）时间、费用以及资源
（5）最优解和最快解
（6）策略风险评估方法
4、申报资料整理
（1）跨部门协作的要求
（2）注册人员如何整理资料
（3）满分资料 vs 及格资料
5、风险分析、规避以及应对方案
（1）注册常见风险
（2）风险评级以及可接受度
（3）不同级别风险的对应方案
6、有效的沟通交流
（1）沟通内容设计
（2）不同沟通对象如何提问
（3）预先练习的必要性
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会议主要交流内容
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第二天 上午：9:00-12:00 下午：13:30-16:30
第二天：实战申报执行策略以及案例解析
三、药品上市注册申报及其管理
1、IND申报策略与实施管理
（1）IND的资料要求
（2）中美IND的差异以及双报策略
（3）IND审评关注点
（4）IND成药性分析
2、NDA/BLA申报策略与实施管理
（1）NDA/BLA的资料要求
（2）中美NDA/BLA的差异以及双报策略
（3）NDA/BLA审评关注点
（4）新药临床价值评估
3、改良新药申报特点
（1）改良新药的挑战
（2）中外改良型新药的不同定义
（3）改良型新药中外同时申报的可能性
（4）改良型新药成药性及其价值评估
4、仿制药的注册管理以及一致性评价
（1）参比制剂遴选及其相应问题
（2）老产品如何挑选参比制剂
（3）欧盟上市产品如何选择参比制剂
（4）仿制药与原研一致性的分析
（5）仿制药免除BE的情况
（6）中外仿制药开发要求
（7）ANDA可以作为FDA以及EU的敲门砖
四、产品上市后维护要求
1、变更分类分析及其补充申请要求考量
（1）上市后变更的重要性：商业影响
（2）变更分类的分析及其带来的影响
（3）补充申请递交如何不影响商业销售
（4）多个变更合并递交还是单个递交
（5）补充申请不同递交策略的风险
2、再注册申报常见问题
（1）再注册申报要求
（2）原料药以及制剂再注册的异同
（3）再注册申报常见问题和挑战
（4）如何分析和协调同时发生变更以及再注册
3、原辅包关联审评特点
（1）原辅包关联审评历史介绍
（2）FDA的DMF以及与国内关联审评的对比
（3）关联审评下制剂如何挑选原辅包供应商
（4）关联审评过程中制剂与原辅包的合作（一荣俱荣，一损俱损）
✦ 参会对象 ✦
药物研发、生产企业的药物注册事务的专员及主管人员；国内外监管机构人员；大专院校、科研机构等相关人员。
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会议费用
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会务费： 4000元/单位（会务费包括：培训、研讨、纸质及电子资料、视频回放、培训证书等）； 注： 腾讯会议直播 。
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会议说明
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1、理论讲解,实例分析,专题讲授,互动答疑
2、主讲嘉宾均为行业内资深专家，欢迎来电咨询
3、企业需要内训和指导，请与会务组联系
报名回执表 ✦
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✦ 汇款账号 ✦
户 名：北京华夏凯晟医药技术中心
开户行：中国工商银行股份有限公司北京玉泉路支行
账 号： 020 006 300 920 0091778
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培训报名负责人：王老师
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会议培训汇总
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| 线上 | 1 月07-08日 | 【线上】抗体药物工艺验证及转移、病毒灭活验证、下游工艺性能确认策略实施 |
| 线上 | 1 月07-08日 | 【线上】药品研发项目管理全流程实施 |
| 线上 | 1 月07-08日 | 【线上】GMP管理体系的搭建改善及变更、偏差实施策略解析 |
| 线上 | 2 月25-26日 | 【线上】药企合规性自检内审专管人员内部检查技巧实战应用 |
| 线上 | 2 月25-26日 | 【线上】药品注册事务体系构建及实战申报执行策略实操 |
| 线上 | 2 月25-26日 | 【线上】中美欧药物警戒体系搭建实施要点应用实操 |
| 线上 | 3 月05-07日 | 【线上】药品注册电子申报实操演练及CTD撰写 |
| 线上 | 3 月25-26日 | 【线上】抗体药物工艺验证及转移、病毒灭活验证、下游工艺性能确认策略实施 |
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