Adv Sci | 鉴定组蛋白赖氨酸乙酰乙酰化是受HBO1调控的动态翻译后修饰

今天给大家介绍一篇 2023 年发表在 Advanced Science 上的文章，标题是 Identification of Histone Lysine Acetoacetylation as a Dynamic Post-Translational Modification Regulated by HBO1 ，本文的通讯作者是来自中国科学院上海药物研究所的黄河教授。

研究背景：

β- 羟基丁酸 (BHB) 、乙酰乙酸酯和丙酮共同形成酮体。当葡萄糖不易获得时，酮体分子们通过生酮作用从肝脏中的脂肪酸产生的。在极端的生理变化（如饥饿）或病理条件（如糖尿病）下，酮体的水平显著升高。其中， BHB 可以使得赖氨酸产生β - 羟基丁酸化（ Kbhb ）修饰。有研究表明，组蛋白 Kbhb 修饰可直接刺激基因表达，并且与饥饿相关基因的活跃表达相关。以 β- 羟基丁酰辅酶 A 作为底物， p300 可以催化 Kbhb 的生成，而组蛋白脱乙酰酶 1 (HDAC1) 和 HDAC2 可以去除 Kbhb 。 Kbhb 及其调控机制的发现促使作者假设乙酰乙酸（另一种酮分子和短链脂肪酸）也可以作为其相应翻译后修饰（ PTM ）赖氨酸乙酰乙酰化 (Kacac) 的前体。

研究结果：

1. 组蛋白赖氨酸乙酰乙酰化的鉴定

根据酰化修饰在质谱中产生质量偏移的行为，作者计算出 Kacac 修饰多肽中的质量位移为 +84.0211 Da （单同位素质量， C4H4O2 ） ( 图 1) 。作者从培养的人细胞和大鼠肝脏中提取组蛋白，进行蛋白质组学分析，寻找赖氨酸残基质量偏移为 +84.0211 Da 的肽段。这些肽段是在没有使用修饰特异性抗体进行富集的情况下检测的。

图 1 鉴定赖氨酸乙酰乙酰化 (Kacac) 的蛋白质组学方法。

2.Kacac 的 MS/MS 验证

使用人 HepG2 和 MCF7 细胞系，运用蛋白质组学方法，作者鉴定到了 30 条潜在的 Kacac 肽段，包括 H3K9 (K _+84.02 STGGKprAPR) 、 H3K18(K _+84.02 QLATKprAAR) 和 H4K31 (DNIQGITK _+84.02 PAIR) 。为了进一步验证这些修饰位点的真实性，作者合成了这三条修饰肽段。与预期一致，合成肽 (H4K31 ， DNIQGITK acac PAIR) 显示出与内源性肽段几乎相同的碎片离子 ( 图 2a) 。此外，内源性肽段和合成肽段在高效液相色谱中共洗脱 ( 图 2b) 。这两条证据有力地表明， +84.02Da 的质量偏移确实归因于赖氨酸的乙酰乙酰化。对另外两个合成肽及其对应的内源性多肽的分析证实了这一结论。

图 2 使用合成肽和同位素标记验证赖氨酸乙酰乙酰化 (Kacac) 。

3. 乙酰乙酸是 Kacac 的前体

前文提到过，由于 Kbhb 受到 BHB 的调控，作者认为 Kacac 可能受到乙酰乙酸的调控。作者进行了同位素标记实验来证明这种可能性。使用 10mM ¹³ C ₂ - 乙酰乙酸乙酯（ EAA ）处理 HepG2 和 MCF7 细胞 24 小时，然后提取组蛋白，对蛋白或肽段进行丙酰化处理。

用平行反应监测 (PRM) 分析细胞中产生的肽段，以检测同位素标记的 Kacac 位点 ( 图 2c) 。从 HepG2 细胞中识别到 5 个带有 ¹³ C ₂ 标记的乙酰乙酰化组蛋白 Kacac 位点 ( 图 2d) 。用同样的方法从 MCF7 细胞组蛋白上确定了六个同位素标记的 Kacac 位点。综上所述，乙酰乙酸是组蛋白 Kacac 的代谢前体。

4. 泛抗 Kacac 抗体验证组蛋白 Kacac 修饰

作者使用 Kacac 修饰的多肽作为免疫原，希望生成 Kacac 修饰的特异性抗体，但在兔体内没有观察到修饰特异性的免疫原性。然后作者希望转而使用带有模拟 Kacac 结构的多肽来生产抗体。在生理条件下，甲基异恶唑基可以转化为乙酰乙酰基的结构类似物 ( 图 3a) 。因此，作者合成了赖氨酸残基上含有甲基异恶唑结构的多肽作为替代抗原，以产生泛抗 Kacac 抗体。通过使用包含 Kacac 、 KCR 、 Khib 、 KSU 和未修饰赖氨酸的多肽库进行斑点印迹分析，证实了所产生的抗 Kacac 抗体的特异性 ( 图 3b) 。 2- 羟基异丁酰化、琥珀酸化和未修饰的多肽没有结合，而巴豆酰化的多肽结合更低。该抗体的特异性得到了证实。

使用这种新产生的泛抗 Kacac 抗体，作者在不同的动物物种中检测到组蛋白 Kacac ，包括人、鼠和斑马鱼 ( 图 3c) 。鉴于酮体是一种进化上保守的代谢物， Kacac 很可能类似于乙酰化和巴豆酰化修饰，在不同的物种中普遍存在。

图 3 泛抗 Kacac 抗体的制备与验证

5. 组蛋白 Kacac 受 EAA 和酮发生途径的动态调控

短链酰基 -CoA 可由其相应的短链脂肪酸生成。例如，乙酸和 BHb 可以生成乙酰辅酶 A 和 BHb-CoA ，因此它们可以作为 KAc 和 KbHb 的前体。所以，作者认为组蛋白 Kacac 可以受细胞内乙酰乙酸水平的调控。

为了验证这一假设，作者用 0-1 mM 的 EAA 处理 HepG2 细胞 24 小时。与预期一致， EAA 处理后 24 小时组蛋白 Kacac 水平随 EAA 浓度的增加而增加 ( 图 4a) 。相比之下，只观察到 Kpr 水平的轻微增加，而其他组蛋白酰化、 KAc 、 Kcr 和 Kbu 没有明显变化 ( 图 4a) 。考虑到从乙酰乙酸到 - 羟基丁酸的代谢转化， KBHb 略有上调也就不足为奇了。为了证实这一说法，作者用乙酸或 EAA 处理 HepG2 细胞，并进行免疫荧光实验，以确定它们对 Kacac 和 KAc 水平的影响。事实上， EAA 显著增强了 Kacac 的荧光信号，而没有诱导 KAc( 图 4b) 。与 KAc 相似，不同的细胞在 Kacac 水平上观察到异质性，其中一些细胞表现出更强的信号，这可能是由于不同细胞对 EAA 的不同摄取或调节因子的不同丰度所致。这一结果表明， Kacac 和 Kac 虽然都定位于细胞核，但受到不同机制的调控。

接下来，作者探究 Kacac 水平是否与酮体分子的产生有关。将细胞暴露在不同浓度的 Hymeglusin （真核细胞 HMG-CoA 合成酶的特异性 - 内酯抑制剂，该酶催化乙酰乙酰辅酶 A 向 HMG-CoA 的转化）中，该抑制剂有望增加细胞内乙酰辅酶 A ，降低 HMG-CoA 水平。事实上，组蛋白 Kacac 水平在用 Hymeglusin 处理后显著增加，这间接表明乙酰乙酰辅酶 A 是 Kacac 的前体 ( 图 4c) 。这些结果表明，组蛋白 Kacac 受细胞内乙酰乙酸酯和乙酰乙酰辅酶 A 水平的动态调节。

作者推测，一些组蛋白赖氨酸残基可能对 EAA 更敏感，这可能介导了下游的信号通路。因此，以特定位点的方式表征组蛋白 Kacac 的动力学特性对于理解 Kacac 的功能至关重要。在有或没有 EAA 处理 (10 mM) 的 HepG2 细胞中，对含有 KAc 和 Kacac 的多肽进行了定量。通过将含有 KAc 或 Kacac 修饰的多肽的光谱计数 除以 包含靶序列的多肽的总光谱计数 来计算修饰位点的相对占位比。在未经 EAA 处理的样品中， Kacac 和 Kac 均位于 H3K9 、 H3K18 、 H3K27 、 H4K5 、 H4K8 和 H4K31 这 6 个赖氨酸位点上。三个组蛋白 H3 位点， H3K36 ， H3K56 和 H3K79 ，只被 Kacac 修饰，而不被 Kac 修饰 ( 图 4d) 。总体而言， Kacac 位点的占位比略低于未经 EAA 处理的 KAc 位点。然而，在 EAA 处理的细胞中， Kacac 水平显著上调。检测到较多的 Kacac 位点，如 H2AK5 、 H2AK36 、 H2AK199 、 H2BK46 、 H3K122 和 H4K79 。在大多数位点， Kacac 的总体占位比高于 Kac( 图 4e) 。这一系列证据强调了这样一种可能性，即组蛋白上的 Kacac 水平随着乙酰乙酸酯水平和酮的生成而动态上调。鉴于 Kacac 的高占位比，这种修饰可能可以通过对组蛋白蛋白的功能产生整体的影响，调节饥饿相关基因的转录（与 Kbhb 类似）。

图 4 乙酰乙酸和乙酰乙酸辅酶 A 对 Kacac 的动态调节。

6.HBO1 是一种赖氨酸乙酰乙酰化转移酶

Kacac 的动态变化促使作者探究其潜在的监管机制。越来越多的证据表明经典的乙酰转移酶也可以调节各种新发现的酰化修饰。例如， p300 被认为是混杂酰基转移酶，可以催化各种酰基部分向赖氨酸残基的转移，包括乙酰基、乳酰基、琥珀酰基和甲基丙烯酰基。考虑到这些观察结果，作者假设一些乙酰转移酶可以起到乙酰乙酰转移酶的作用。

作者分别用编码五种常规乙酰转移酶（ p300 、 GCN5 、 HBO1 、 Tip60 和 MOF ）的质粒转染 HEK293T 细胞（图 5a ）。这些酶的过度表达 (OE) 上调了 Kac 水平。同时，它们均不同程度地升高了组蛋白 Kacac 水平，其中 GCN5 和 HBO1 过表达导致的 Kacac 升高最为明显。

为了确定受 GCN5 和 HBO1 调节的位点，通过 PRM 质谱分析来分析来自这些乙酰转移酶过表达细胞的组蛋白肽。 GCN5 过表达细胞中两个 Kacac 位点 H2AK5 和 H4K12 的占位比增加，而在 HBO1 过表达细胞中， H2BK34 、 H4K12 和 H4K79 的占位比增加了两倍以上。此外， H2AK5 和 H2BK16 仅在 HBO1 过表达细胞中检测到。这些结果表明 HBO1 是一种乙酰乙酰转移酶，可调节多个组蛋白 Kacac 位点。

为了证实 HBO1 的酶活性，作者在 HEK293T 细胞中过表达 HBO1 的野生型和无催化活性的突变体 (G485A/E508Q) 。组蛋白 Kacac 的水平在野生型 HBO1 过表达时增强，而突变型 HBO1 无法使得 Kacac 水平增加（图 5b ）。

为了进一步证实离体结果，作者使用重组蛋白进行了体外测定。野生型 HBO1 催化 Kacac 反应；然而，突变体几乎没有表现出这种活性（图 5c ）。已知 JADE1 可以促进 HBO1 介导的乙酰化反应。作为对照， HBO1 提高了 Kac 水平， JADE1 进一步提高了 Kac 水平；然而， HBO1 突变体不会产生这种增加。但是，添加 JADE1 并没有导致 Kacac 的进一步增加。作者采用了体外荧光酰化测定，使用乙酰乙酰辅酶 A 作为辅因子，以合成的人组蛋白 H4 肽作为底物，进一步对 HBO1 的酶活性进行了动力学测定。作者定量比较了 Kac 和 Kacac 反应中 HBO1 的酰基转移酶活性。 HBO1 的 Kacac 的 Kcat/Km 为 2063 s − 1 m − 1 ，约占 Kac 的 Kcat/Km 的 56% （图 5d ）。总的来说，这些结果表明 HBO1 在体外和细胞内都能催化 Kacac ，而 JADE1 在体外对 HBO1 的乙酰乙酰转移酶活性没有协同作用。

作者使用 AutoDock 对与 HBO1 结合的乙酰乙酰辅酶 A 进行了 3D 计算机分子建模（图 5e ）。 HBO1 中的 CoA 结合口袋可以装下乙酰乙酰 CoA 。此外，乙酰乙酰基部分位于口袋的底部，与 Pro510 和 Leu511 残基形成疏水相互作用。与乙酰辅酶 A 类似，与硫原子相邻的羰基与 Ile475 的氮原子形成氢键。此外，乙酰乙酰基部分的 - 羰基与主链上 Ser512 的氮原子形成额外的氢键，稳定乙酰乙酰辅酶 A 的结合。为了验证参与 HBO1 和乙酰乙酰辅酶 A 之间相互作用的关键氨基酸残基，作者使用 HBO1 的野生型 (WT) 和多个突变体（ Pro510A 、 Leu511A 、 Ile475A 和 Ser512A ）在 HEK293T 细胞中进行了过表达实验。 WT HBO1 的过度表达导致组蛋白 Kacac 水平升高。然而，在表达突变型 HBO1 变体的细胞中没有产生这种效应（图 5f ）。这些发现足以证明 HBO1 与乙酰乙酰辅酶 A 结合，并通过预测的关键氨基酸残基发挥其催化活性。

图 5 HBO1 乙酰乙酰转移酶活性的验证。

7. HDAC3 被鉴定为赖氨酸脱乙酰乙酰酶

PTMs 的去除也是调节它们的另一个重要方面。已知组蛋白修饰可被组蛋白脱乙酰化酶 (HDAC) 家族去除，包括去乙酰化酶 (SIRT) 。例如， sirtuin 5 (SIRT5) 通过从目标赖氨酸残基中去除琥珀酰化和丙二酰化部分来进行脱琥珀酰化和脱丙二酰化。此外，最近报道 HDAC 筛选显示 HDAC3 可以催化体外赖氨酸甲基丙烯酸化的去除。在这里，我们推测 Kacac 可能受到 HDAC 家族的调节。为了检验我们的假设，我们用 HDAC 抑制剂辛二酰苯胺羟酰胺酸 (SAHA) 或 SIRT 抑制剂烟酰胺处理 HepG2 细胞，并在处理后 24 小时通过免疫印迹检查组蛋白 Kacac 水平。 SAHA 处理后，组蛋白 Kacac 水平与 Kac 水平一致，呈浓度依赖性增加，而烟酰胺处理后没有发生显著变化（图 6a ）。

为了进一步确定哪种特定 HDAC 具有脱乙酰乙酰化酶的活性，作者使用合成的 Kacac 肽 H3K9 (KacacSTGGKprAPR) ， H3K18 (KacacQLATKprAAR) 和 H4K31 (DNIQGITKacacPAIRR) 对 HDAC 1-11 进行了体外筛选。通过 LC-MS/MS 定量未修饰肽的比例，我们发现只有 HDAC3 显示出明显的去乙酰乙酰化酶活性，其中 H3K9 、 H3K18 和 H4K31 分别有 6.9% 、 16.3% 和 24.1% 的修饰肽被去乙酰乙酰化（图 6b) 。该结果表明 HDAC3 可以在体外催化去除组蛋白乙酰乙酰化。

图 6 HDAC3 催化的组蛋白脱乙酰乙酰化。

8. 组蛋白 Kacac 谱图构建

为了进一步增加 Kacac 位点的识别，作者分析了其他大鼠器官中的 Kacac ，包括肝脏、肾脏、肺和脾脏。作者分别在肝、肾、肺和脾样本的组蛋白上鉴定出了 11 、 13 、 10 和 14 个 Kacac 位点，将大鼠器官中鉴定出的 Kacac 位点与人类 HepG2 和 MCF7 细胞中检测到的位点进行整合（图 7 ）。总共鉴定出 33 个 Kacac 位点，其中大多数位点在人类和大鼠中均检测到。接下来，作者总结了研究中确定的所有 Kacac 位点，并将它们与其他常见的组蛋白赖氨酸短链酰化（包括琥珀酰化、乳酰化、巴豆酰化和乙酰化）进行比对，发现许多 Kacac 位点与先前鉴定的赖氨酸酰化重叠。

图 7 人类和大鼠细胞核组蛋白的 Kacac 图谱。

图 7 人类和大鼠细胞核组蛋白的 Kacac 图谱。