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苏大陈倩教授团队 Sci. Adv.: 新型水凝胶 - 控制脉络膜黑色素瘤和玻璃体切除术后视力

时间：2023-11-12 来源： 浏览：

苏大陈倩教授团队 Sci. Adv.: 新型水凝胶 - 控制脉络膜黑色素瘤和玻璃体切除术后视力

化学与材料科学
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脉络膜黑色素瘤 是一种常见于成人的原发性眼内恶性肿瘤，致死率高，治疗效果差。 临床上常用斑块近距离放射治疗和质子束放射治疗来局部控制早期脉络膜黑色素瘤。然而，这些疗法仍有许多局限性。 例如，斑块近距离放射治疗通常剂量分布不均，容易产生热点（高剂量区）和冷点（低剂量区），并有引起放射眼底病的风险。 质子束放疗通常需要高昂的成本来建造和维护质子中心 ，这使得患者无法轻易获得治疗。这些放射治疗对较大型脉络膜黑色素瘤的疗效有限。此外，患眼球去核是治疗较大型脉络膜黑色素瘤的传统方法，但这是一种毁容性手术，会对患者的身 心造成严重影响。

近日， 苏州大学陈倩教授团队 报道 开发了一种基于乙二醇的治疗性人工玻璃体（AVB）水凝胶，可用于控制脉络膜黑色素瘤的复发并保护玻璃体切除术后的视 力 。在脉络膜黑色素瘤小鼠模型中，手术切除后注射了含有美法仑（Mel）和抗程序性细胞死亡配体-1（αPDL1）的 AVB。之后，从 AVB 中依次释放的 Mel 和 αPDL1 可发挥协同抗肿瘤作用，抑制肿瘤复发。AVB 具有与原生玻璃体相似的物理特性，可在玻璃体切除术后维持眼球的正常结构和视觉功能，这一点已在小鼠模型的眼科标准检查中得到证实。因此，具有免疫治疗作用的 AVB 有可能成为辅助眼内恶性肿瘤手术治疗的填充生物材料。相关工作以题为“An immunotherapeutic artificial vitreous body hydrogel to control choroidal melanoma and preserve vision after vitrectomy ” 的文章发表在  Science Advances 上。

本研究 开发了一种基于四臂聚乙二醇（Tetra-PEG）高支化聚合物的人工玻璃体（AVB）水凝胶，用于控制脉络膜黑色素瘤的复发，同时保护玻璃体切除术后的视力 （图 1）。简而言之，  Tetra-PEG-SH和Tetra-PEG-MA混合制备的 AVB 具有极低的膨胀压力、超低的聚合物含量和良好的生物相容性，是一种很有前途的人工玻璃体 。这种 AVB 还可以作为药物储存库，依次释放美法仑（Melphalan，一种用于眼内恶性肿瘤动脉输注化疗的小分子药物）和抗程序性细胞死亡配体-1（αPDL1，一种通过阻断 PD-1/PD-L1 通路恢复 T 细胞功能的免疫检查点阻断抗体）。快速释放的Mel可诱导免疫原性细胞死亡（ICD），从而进一步提高αPDL1的免疫应答率，实现协同抗肿瘤免疫应答。在小鼠脉络膜黑色素瘤模型中，Mel&αPDL1@AVB能有效抑制肿瘤术后复发，延长小鼠眼球保存时间。同时，本研究通过眼压计裂隙灯、眼底荧光素血管造影（FFA）、光学相干断层扫描（OCT）和视网膜电图（ERG）的测量，证明玻璃体切除术后以 AVB 作为人工玻璃体可长期保持眼球的视功能。因此，免疫治疗性 AVB 水凝胶应成为玻璃体视网膜手术后治疗眼底阶段（肿瘤生长尚未对眼睛造成不可逆损害的阶段）眼内恶性肿瘤的重要手术辅助手段。
图1 用于玻璃体切除术后脉络膜黑色素瘤治疗的免疫疗法 AVB 水凝胶示意图
AVB 水凝胶的制备 分两步进行（图 2A）。第一步，将过量的 Tetra-PEG-MA 与 Tetra-PEG-SH 按 0.8/0.2 的比例混合（总质量分数 = 1 wt %，比例 = [Tetra-PEG-MA]/[Tetra-PEG-SH]），形成环绕马来酰亚胺基团的纳米凝胶（MA 纳米凝胶），其均匀的水动力学尺寸为 38 nm。同样，将 Tetra-PEG-SH 和 Tetra-PEG-MA 按 0.8/0.2 的比例混合（总质量分数 = 1 wt %，比例 = [Tetra-PEG-SH]/[Tetra-PEG-MA]），制备出了另一种纳米凝胶（SH 纳米凝胶），其大小与 Tetra-PEG-SH 类似，但表面覆盖有巯基。根据Tetra-PEG-MA与Tetra-PEG-SH混合前后的紫外可见吸光度以及Tetra-PEG-MA在300 nm处的浓度依赖性吸光度曲线，本研究发现这两种Tetra-PEG在不同比例下可以完全相互反应。同时，对得到的 MA 纳米凝胶和 SH 纳米凝胶进行了透射电子显微镜（TEM）成像表征。如图 2B 所示，MA 纳米凝胶和 SH 纳米凝胶表现出相似的球形形态和均匀的尺寸（约 30 nm）。第二步，将等量的 MA 纳米凝胶和 SH 纳米凝胶混合，合成 AVB 水凝胶（图 2B，最初为无色凝胶，为了更好地观察，加入了彩色染料）。扫描电子显微镜成像显示，冷冻干燥的 AVB 水凝胶呈现多孔结构，孔径在 10 到 100 μm 之间（图 2C）。
考虑到第一步中四聚乙二醇-MA 和四聚乙二醇-SH 的比例以及聚合物的总浓度是 AVB 水凝胶制备过程中的关键变量，本研究 对 制备 MA 纳米凝胶和 SH 纳米凝胶时四聚乙二醇-MA/四聚乙二醇-SH 的比例以及总质量分数进行了优化 。如图 2D 所示，要形成 MA 或 SH 纳米凝胶，[Tetra-PEG-MA]/[Tetra-PEG-SH]的比例应分别大于 0.6/0.4 或小于 0.4/0.6，否则在第一步混合时，整个溶液会迅速凝胶化。在最佳[Tetra-PEG-MA]/[Tetra-PEG-SH]比例分别为 0.8/0.2 和 0.2/0.8 时形成的 MA 纳米凝胶和 SH 纳米凝胶在第二步混合后的凝胶时间大致为 10 分钟左右（图 2E）。另一方面，测量了不同总质量分数 AVB 的储存模量（G′）（图 S4）。随着总质量分数的增加，AVB 的 G′也随之增加。值得注意的是，1 wt % AVB 的 G′约为 10 Pa，接近原生玻璃体的 G′（36）（图 2G）。因此， 选择总质量分数为 1 wt%的聚合物来进行最终的 AVB 。
图2 AVB 的制备和表征
通过体内荧光成像系统 研究了小鼠玻璃体内注射游离药物混合物或药物负载 AVB 后 Mel 和 IgG 的不同释放动力学 。此处仍使用 RhoB 和 IgG-Cy5.5 代替 Mel 和 αPDL1。如图 3（A 和 B）所示，对于注射了简单混合物的小鼠，RhoB 和 IgG-Cy5.5 的荧光信号在第 7 天分别减少到初始信号的 14.4% 和 35.9%。相比之下，注射了 AVB 的小鼠的 RhoB 和 IgG-Cy5.5 的荧光信号在第 7 天分别保持在初始信号的 37.1% 和 63.9%。因此，AVB 不仅能延长药物在眼内的滞留时间，还能根据药物分子量的不同使负载药物的释放动力学发生变化，大分子药物的释放速度较慢（图 3C）。
图3 AVB 中 Mel 和 αPDL1 的程序释放行为
受AVB中负载药物的程序性释放动力学和Mel诱导的ICD的启发，本研究 评估了Mel & αPDL1@AVB抑制玻璃体切除术后脉络膜黑色素瘤复发的治疗潜力 （图4A）。首先，在每只小鼠的右眼视网膜和脉络膜之间注射表达荧光素酶的 B16F10 细胞，从而建立了小鼠脉络膜黑色素瘤模型。七天后，用体内荧光成像系统（IVIS）对小鼠进行成像。观察到癌细胞发出强烈的发光信号（8 × 10 5  至 1 × 10 6  p sce -1  cm -2  sr -1 ），表明脉络膜黑色素瘤模型的成功建立。同时，将小鼠安乐死，取眼球解剖。在玻璃体腔中观察到明显的癌细胞浸润，这进一步表明脉络膜黑色素瘤肿瘤的成功建立。为了模拟玻璃体切除术后脉络膜黑色素瘤复发的情况，本研究切除了大部分黑色素瘤肿瘤。简单地说，将特制的带钩针尖的注射器经眼缘插入后段，轻轻转动，吸取 VB 和癌细胞的混合物。这种玻璃体切除手术后的总发光强度低于 2 ×  10 5  p  sce -1  cm -2  sr -1 （图 4B）。
图4 玻璃体切除术后 Mel 和 αPDL1@AVB 的治疗效果
受到 Mel 和 αPDL1@AVB 取得的良好治疗效果的鼓舞，本研究随后 评估了 Mel 和 αPDL1 在体内诱导的免疫反应 （图 5A）。首先，在不同处理2天后采集小鼠眼球进行免疫荧光染色。如图5（B和C）所示，Mel@AVB或Mel & αPDL1@AVB处理的小鼠脉络膜黑色素瘤中CRT、HMGB1和HSP70的水平明显升高，表明 Mel确实能诱导体内肿瘤细胞的ICD 。ICD过程中释放的这些DAMPs可与树突状细胞（DCs）表面的模式识别受体结合，引发一系列细胞学反应。因此，在不同治疗 5 天后，用流式细胞术测量了脉络膜黑色素瘤中 DCs 和 T 细胞的数量。如图 5D 所示，Mel@AVB 组和 Mel & αPDL1@AVB 组颈部淋巴结中成熟 DC 细胞（CD11c + CD80 + CD86 + ）的数量明显高于 AVB 组和 αPDL1@AVB 组，表明  Mel 诱导的 ICD 能有效促进颈部淋巴结中 DC 细胞的成熟 。
图5 Mel 和 αPDL1@AVB 植入诱导的免疫反应
接下来，本研究想 探究 AVB 是否适合在玻璃体切除术后替代原生 VB 以保持视力 。为了证明 AVB 在玻璃体切除术后的应用，本研究向玻璃体切除术后的健康小鼠玻璃体内注射了临床上常用的玻璃体切除术后填塞物硅酮油（5 μl）或 AVB 水凝胶（5 μl）。然后，通过眼压计和视网膜成像显微镜系统地观察了小鼠术后不同时间点的眼球结构和视网膜功能（图 6A）。如图 6B 所示，AVB 组小鼠的眼压维持在 10 至 15 mmHg 之间，处于正常范围，说明 AVB 在 VB 中没有发生降解或肿胀而引起眼压变化。然而，硅油组有两只小鼠在 6 个月时眼压升高，这可能是硅油乳化所致。此外，本研究用裂隙灯对眼球前部进行了评估（图 6C），发现注射 AVB 的眼球与正常眼球无异，证明 AVB 对眼球前部的结膜和其他结构几乎没有异常影响。然而，硅油组有两只小鼠在 6 个月时眼睛前部出现了白色不透明斑块，这可能是白内障或青光眼的征兆。接下来，用 FFA 和 OCT 评估视网膜血管渗漏和视网膜厚度。如图 6D 所示，接受 AVB 治疗的小鼠眼底血管完好无损，没有渗漏。根据周围（红线位置）的 OCT 扫描（图 6D），本研究发现 AVB 组小鼠眼睛的视网膜结构和厚度与健康小鼠的差异微乎其微。然而，硅油组的两只异常眼由于病变位置的影响，在6个月时无法进行正常的眼底和OCT成像。因此，与硅油相比， AVB 在较长的填充期内不会对眼球结构产生任何影响 。
图6 评估眼球结构和视网膜功能
综上 ，本研究合成了由四聚乙二醇-MA和四聚乙二醇-SH组成的免疫治疗型AVB水凝胶，旨在同时作为理想的玻璃体替代物和药物储库，以保护视力并持续释放免疫治疗药物，抑制眼内恶性肿瘤的复发。AVB 水凝胶具有合适的凝胶化时间（符合临床上的相关操作时间）、低膨胀压力和与 VB 相当的弹性模量，可用作手术切除后的理想玻璃体填充植入物。此外，AVB 还能有效地负载并依次释放化疗药物（Mel）和免疫检查点抑制剂（αPDL1），且释放动力学各不相同。分子量较小的 Mel 能迅速从水凝胶中释放出来，通过释放大量 DAMPs 来招募各种类型的免疫细胞，从而诱导癌细胞的 ICD。这种效应与随后释放的 αPDL1 共同作用，能够激活协同抗肿瘤免疫反应。结果， Mel & αPDL1@AVB有效地抑制了脉络膜黑色素瘤小鼠术后肿瘤的复发，延长了眼球的保存时间 。同时，植入 AVB 水凝胶 6 个月后的眼球结构和视网膜功能评估结果表明， AVB 应是一种理想的玻璃体替代物，能无不良反应地保留眼睛的视功能 。因此，由人工泪液中常用的四聚乙二醇（Tetra-PEG）组成的免疫治疗型 AVB 水凝胶有可能成为玻璃体视网膜手术中治疗眼球内生期恶性肿瘤的重要手术辅助材料。此外，基于 AVB 水凝胶独特的物理特性，它还有可能被用于视网膜黄斑变性和眼内感染等更广泛的领域。

原文链接

https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adh1582
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