忆往昔，19世纪80年代，微生物学奠基人科赫发明了固体培养基技术。看今朝，130多年来微生物纯菌成功培养彻底改变了微生物学。（推荐前期博文：
谁，开创了微生物纯培养技术
）
但在微生物纯培养过程中总会出现“平板计数异常”（great plate count anomaly）之现象，即总细胞计数和可培养细胞计数之间存在差异，这一现象始终没有很好的解决方法。虽然现在宏基因组的“非培养”技术和一些新的单细胞分离技术正在大展拳脚，但基于固体平板的微生物筛选技术仍是主流和基础。
很多微生物在固体平板上不能生长，原因很多，包括需要特定维生素、菌株互作、琼脂的抑制性，以及一些微生物特立独行的“不可教化”。除了这些因素，还有其他原因吗？
日本北海道大学的Yoichi Kamagata教授团队的系列研究简单、有趣且很有意义。
2014年，研究者在实验室分离真菌T-27
T
时发现该真菌在琼脂平板上生长不良（CFU计数很低，生长缓慢），多年来一直无法进行培养，但在用结冷胶固化的培养基上生长良好。两种生长介质之间的唯一区别是所使用的胶凝剂，研究人员用两种不同方法制备的琼脂生长培养基上进行培养，即正常的磷酸盐和琼脂混合在一起灭菌（PT法，T一起）；以及磷酸盐和琼脂分开高压灭菌（PS法，P为磷酸盐，S分离）。
结果表明，当琼脂和磷酸盐单独进行高压灭菌与一起进行高压灭菌时，在固体培养基上的菌落数量有明显的差异。琼脂与磷酸盐如胶似漆一起高压灭菌时，平板上长的菌很少，且随磷酸盐浓度增加，固体培养基对微生物的抑制效果也会非线性增加。即爱得越深，对第三者杀伤越大。
当从培养基中去除磷酸盐，分别将磷酸盐和琼脂（PS）单独高压灭菌，在此平板上长的菌数目远高于一起高压灭菌培养基上的菌数目。
根据作者的多年研究经验，可能培养基在高温高压条件下产生了新的杀菌化合物，这个化合物非常有可能是活性氧物种，
随即他们对过氧化氢的浓度进行测定，成功锁定真凶：过氧化氢！
除了磷酸盐琼脂一起高温高压灭菌外，还有什么支持产生过氧化氢产生的条件呢，研究人员发现：过氧化氢的形成依赖于pH，而铵离子促进了磷酸盐催化的过氧化氢的形成；通过添加过氧化氢酶或丙酮酸，有效地消除了过氧化氢。
进一步实验结果表明，以土壤、河流和沉积物作为微生物培养来源单独灭菌培养基上生长的新菌株的比例均高于来自所有三种环境源的混合灭菌培养基。特别是，从单独灭菌培养基上获得的分离物有超过30%的为迄今未培养微生物。由此提出，高浓度的磷酸盐应与琼脂分离高压灭菌，以最大限度地增加CFU；低磷酸盐浓度（0.1mM以下），可能足以满足许多环境细菌的生长。
通过结合单独灭菌培养基和长时间培养，可以用来分离系统发育上的新细菌。接种森林土壤或池塘沉积物样品后，单独灭菌培养基上出现的菌落明显多于混合灭菌培养基。对其16S rRNA基因的测序分析表明，从单独灭菌培养基中恢复的生长缓慢的菌比从混合灭菌培养基中有更多的系统发育新菌。对代表性菌株的进一步生理分析表明，它们实际上是生长缓慢菌株，仅在单独灭菌培养基上形成小但可见的菌落。至此，
简单的分开灭菌的实用价值得到了证实。
固体培养基杀菌事件初步得以揭秘，但其手刃了多少微生物？杀菌的临界点又几何呢？对此，研究人员从待培养样品来源，过氧化氢浓度等不同条件出发对这些问题进行了进一步的研究。
研究发现，实验室菌株比野生未驯化培养的菌株更具有过氧化氢抗性，尤其是大名鼎鼎的大肠杆菌、红球菌、假单胞菌和芽孢杆菌等，更是具有极高的过氧化氢耐受性。
而野生菌对过氧化氢的耐受能力就要差了很多，微量浓度的过氧化氢就能对其产生极强的抑制效果。测试了部分微生物的过氧化氢敏感性，并基于其耐受性控制固体培养基中过氧化氢浓度，成功分离到了对过氧化氢高敏感的菌株。
系列研究表明琼脂平板中过氧化氢的低微摩尔水平对环境微生物的生长有严重影响，这进一步说明在培养基制备过程中产生的过氧化氢的微摩尔水平可能是导致平板计数异常的原因之一。对过氧化氢敏感菌株的进一步研究，包括详细分析其对不同过氧化氢水平的敏感性程度，以及其基因组编码的过氧化氢酶和其他过氧化氢降解酶的活性，可能有助于阐明过氧化氢易感性的机制。
液体培养基和琼脂是微生物学历史上最有名的伴侣，有道是：天长地久有时尽，小别亦可胜新婚。
简单的培养基和琼脂分开灭菌，会产生意想不到的效果，能孕育出更多的小小生命体。
参考文献
1. Watanabe M, Igarashi K, Kato S, et al. Critical effect of H2O2 in the agar plate on the growth of laboratory and environmental strains. Microbiology Spectrum, 2022,10: e03336-22
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本文作者，课题组硕士研究生潘汉卿，文章有改动
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