ACS Chem. Biol. | “突变-偶联”：一种快速验证细胞内靶标的方法
ACS Chem. Biol. | “突变-偶联”：一种快速验证细胞内靶标的方法
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英文原题 ： Mutate and Conjugate: A Method to Enable Rapid In-Cell Target Validation
供稿人： 鲁承昊 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇 ACS Chemical Biology 文章，标题为“Mutate and Conjugate: A Method to Enable Rapid In-Cell Target Validation”，文章的通讯作者是来自于牛津大学的Stuart J. Conway教授，在本文中，作者报道将定点突变和亲电片段相结合的思路，首先对目标蛋白进行L94C突变，而后将突变产生的半胱氨酸与亲电基团偶联，此外通过亲电基团上引入叠氮基，用Click反应进行荧光标记。本文工作提供一种概念证明，将突变和偶联相结合的思路能够用于评估目标蛋白的细胞表型，以及促进亲电配体在非共价配体领域的发展。
新药研发在后期临床实验中存在极高的淘汰率，通常是由药物在体内缺乏疗效或出现新的安全风险等因素，而这是由于新药研发早期过程中缺乏有效的靶点验证所导致的。在靶标验证过程中，基因敲低/插入、基因突变和siRNA/shRNA等化学和遗传技术起着重要作用，以将靶标与观察到的表型相联系。然而敲低蛋白所造成的影响复杂，其关联到多结构域中蛋白的所有功能并可能导致细胞中代偿通路的激活。基于上述挑战，通过小分子移除单个蛋白质结构域功能，而不影响骨架和其他结构域功能的方法具有发展潜力。
遗传和药理学方法的结合能够将定点氨基酸突变和小分子提供的空间和时间控制相结合。在以往的研究中采用“bump and hole”方法，即用更小的氨基酸构建突变蛋白形成“hole”其能够选择性容纳与突变型结合的“bump”配体（如图1A所示）。此外，另一种方法是利用半胱氨酸残基的“Tethering”方法，由于半胱氨酸在蛋白质体系中保守性较低以及能与丙烯酰胺、卤代乙酰胺、α,β-不饱和酯存在较高的反应活性，因此能够增加蛋白的亲和力与选择性，通过二硫键发现新的小分子抑制剂（如图1B所示）。本文所用方法综合了以往工作的优势，开发了一种结合位点定向半胱氨酸突变与亲电配体偶联的“mutate and conjugate”技术。
图1. 可用于识别突变蛋白的选择性配体结合方法
本文作者采用BRD4蛋白作为目标蛋白，其功能是读取组蛋白和其他蛋白上的乙酰赖氨酸（KAc）残基。本文作者首先通过探针尝试标记BRD4中原本的赖氨酸残基，以确定野生型蛋白不容易与亲电试剂发生反应，随后通过活性位点结构分析，发现将94位氨基酸突变为半胱氨酸能够在空间上促进其与亲电试剂的反应活性。为了分析L94C突变对BRD4蛋白稳定性影响，采用分子动力学模拟的方法，模拟50纳秒的时间尺度上突变蛋白和野生型蛋白的主干均方根偏差（RMSD）与主干均方根波动（RMSF），结果表明L94C突变对结构影响不显著。
本文通过两种方法筛选能够共价结合半胱氨酸的亲电试剂。在第一种筛选方案中，以小分子抑制剂OXFBD04为模板构建一系列区域异构体，将得到的片段库与BRD4(1)L94C在50μM的浓度下结合，通过蛋白LCMS实验标记二者的结合情况。随后针对BRD4(1)L94C与BRD4(1)WT的选择性进行比对，筛选得到编号为12,14的两种小分子（如图2所示）兼具对突变型蛋白高标记效率与高选择性，二者对BRD4(1)L94C的标记效率达到98%和74%。此外，为了拓宽亲电试剂的范围，作者在第二种筛选方案中评估了250种先前发表的半胱氨酸反应性化合物，利用蛋白LCMS实验对标记结果进行分析，从中筛选出编号为27的小分子（如图2所示），其具有61%的标记效率并且未观测到对BRD4(1)WT的标记现象。
图2. 具有高反应活性与高选择性的亲电试剂
在筛选得到三种具有高选择性的备选片段后，作者通过添加炔基基团以增加其“Click”反应功能（如图3所示）。开发此类探针的目的是为了能够在活细胞中评估其与BRD4(1)L94C靶标的结合情况，并分析其在蛋白质组范围内的靶标选择性。在尝试不同位点添加炔基基团后，作者对所构建探针标记效率进行测定，结果发现于远离亲电位点的芳香环上添加炔基基团不会削弱亲电试剂的标记效率。
图3. 可参与点击反应的特异性探针
为了评估可发生点击反应探针的蛋白质组选择性，将瞬时表达BRD4(1)L94C和BRD4(1)WT的HER293T细胞与探针共孵育，瑞后将细胞裂解液与荧光TAMRA-PEG3-N3染料进行铜（I）催化的炔烃-叠氮点击反应（CuAAC），并通过凝胶荧光成像和考马斯亮蓝进行SDS-PAGE分离并进行表征（如图4所示），结果显示编号为30的探针与BRD4(1)L94C结合能力最高，在预期分子量处有更强的荧光条带，但细胞选择性较低，与其他大量靶标相互作用。相比之下基于γ-内酰胺的42号探针对BRD4(1)L94C特异性最强，几乎不存在标记其他任何蛋白的现象，这可能由于该42号探针的亲核能力较低，标记需要提供足够长蛋白质驻留时间从而允许共价反应发生。
图4. 四种亲电探针对细胞蛋白质组的标记情况
最后作者设计竞争性抑制模型，在BRD4抑制剂OXFBD04的存在下，使用亲电探针进行标记，结果显示OXFBD04的浓度与标记效率成负相关，这与结构分析中二者均位于蛋白质KAc结合口袋中并共价标记BRD4(1)L94C的推断相吻合。
综上，作者通过将定点突变和亲电试剂相结合，在BRD4(1)中引入半胱氨酸残基，并筛选能够特异性识别突变蛋白的亲电试剂，随后构建可发生点击化学探针进行荧光标记，其在细胞中表现出较高选择性。这种“突变与偶联”方法能够推动开发靶蛋白结构功能的选择性探针，从而用于新发现或鲜有研究的靶点研究。
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ACS Chem. Biol. 2023, ASAP
Publication Date: October 24, 2023
https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00437
Copyright © 2023 American Chemical Society
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