亏大了！早点知道这些技巧，蛋白纯化怎么可能这么辛苦
亏大了！早点知道这些技巧，蛋白纯化怎么可能这么辛苦
ShengWuXueBa
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为什么别人做纯化，就是只需要「亲和层析 ＋ 离子交换层析」两步，得到的蛋白又纯又多，到我这就需要对蛋白「生拉硬拽」，纯化步骤比别人多好几个，得到的蛋白却又少又杂。
好几次，临做实验，发现之前提好的蛋白压根就没活性。
你是否在蛋白纯化这座大山上翻山越岭还总摔跟头呢？我们总结了一些纯化可能出现的问题并给予可能原因和解决策略，帮助大家学习。另外 为了更好了解大家纯化实验的习惯和操作难点 ，我们还准备了一份 蛋白纯化的调查问卷 ，请花几分钟填写，以便我们更好了解大家实验的真实需求，帮助大家的科研进展。
本次调研提供 160 份礼品
快扫码参与调研，仅需 3 分钟
先到先得！还有幸运大奖！
活动细则详见文末
做完调研，我们来聊聊 纯化实验出现比较多的三种问题 ，一起看看如何解决吧！
情形一、杂蛋白比目的蛋白还多
原因 1：杂蛋白对目的蛋白的标签也有很高的亲和性，比如 HIS 标签
解决方法：可更换特异性更高的标签如 Strep，如继续使用 HIS 标签，则咪唑浓度必须优化，可分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度；考虑多步纯化，加上离子交换层析纯化和凝胶过滤层析纯化的步骤。
原因 2：杂蛋白和标签蛋白结合在一起
解决方法：使用去垢剂或者还原剂；在纯化缓冲液中增加甘油的浓度减少非特异性的相互反应。
（上下滑动查看）
情形二、蛋白多以沉淀形式存在，可溶性蛋白太少
原因 1：缓冲液的 pH 跟蛋白等电点太过接近
解决办法：使用目的蛋白序列进行等电点预测（https://web.expasy.org/compute_pi/ 输入氨基酸序列即可进行等电点预测），纯化缓冲液 pH 需要接近生理环境但远离蛋白等电点。
原因 2：蛋白的浓度过高，有些蛋白在高浓度的情况下会发生沉淀析出的情况
解决办法：摸索最合适的蛋白浓度，纯化时对蛋白进行浓缩控制蛋白的浓度不要超过沉淀浓度。
原因 3：纯化的温度
解决办法：对蛋白纯化的温度进行控制，大部分蛋白需要尽量在低温的条件下进行纯化，也有些蛋白更倾向于常温。
原因 4：蛋白性质引起的沉淀
解决办法：为目的蛋白选择促溶标签；选择增加可溶性的缓冲液，如在合适的缓冲液中添加 2% 的甘油。
（上下滑动查看）
情形三、纯化出的蛋白无生物活性，无法进行下游的实验
原因 1：破碎细胞提取蛋白时释放的蛋白酶降解了目的蛋白
解决办法：可尽快使用蛋白酶抑制剂
原因 2：纯化的操作导致蛋白的变性
解决办法：低温进行纯化（如环境温度和缓冲液温度）避免高温带来的变性；避免样品反复冻融和剧烈搅动带来的蛋白变性；蛋白被氧化变性，可在缓冲液中加入还原剂，如 DTT 或 β-巯基乙醇。
纯化蛋白没有那么容易,每个蛋白有它的脾气。照搬别人的纯化 protocol，最后结果可能只有惊吓没有惊喜！纯化蛋白首先 需要了解蛋白的性质及后续实验的需求，然后才进行纯化步骤和缓冲液的选择，再进行优化尝试，直到摸索出最适合自己蛋白的纯化流程。
如果您正在进行蛋白纯化学习或者已经是小有成就的纯化高手，欢迎您 填写调研问卷 ，识别下方二维码，只需花费 3 分钟， 160 份科研人专属小礼物等你来拿 ，包括蓝牙耳机、手机支架、抱枕等！提交完整问卷中奖率更高哦！
活动 规则
1. 参与奖限量 100 份： 即日起至 2023 年 3 月 10 日， 前 100 名 完整填写问卷，经信息核实正确后，就有机会获得 小熊创意手机支架 （多种款式随机发放）
2. 幸运奖 50 份： 即日起至 2023 年 3 月 10 日，在完成问卷填写者中随机抽取 50 位幸运儿 ，赢取获得 45 cm 可爱小怪兽抱枕 ！（多种款式随机发放）。
3. 最佳问卷奖 10 份： 在完成问卷填写者中随机抽取 10 份优质问卷 ，赢取获得小米真无线蓝牙耳机。
活动说明
1. 礼品将于活动结束后 7 个工作日内安排发放。
2. 每人或每个手机号限领 1 份，如发现 问卷内容乱填、错误等内容 ，则 默认放弃礼品 。
内容策划：王丹琦 内容审核：朱超敏
题图来源：图虫创意
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