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黄和/金明杰团队:先进生物技术在纤维素燃料乙醇中的应用及展望

时间:2023-11-27 来源: 浏览:

黄和/金明杰团队:先进生物技术在纤维素燃料乙醇中的应用及展望

非粮生物质利用 生物基能源与材料
生物基能源与材料

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当今,纤维素燃料乙醇作为一种可再生能源能够实现我国能源领域多方面的转型和改进,推动其持续发展具有重大市场潜力和应用前景。

近日, 南京师范大学食品与制药工程学院 黄和教授 团队与 南京理工大学环境与生物工程学院 金明杰教授 团队在《生物加工过程》期刊发布《 先进生物技术在纤维素燃料乙醇中的应用及展望》一文。关于纤维素燃料的重要性、主要挑战及突破等做了重要综述。

01

新时代下继续发展纤维素燃料乙醇的重大挑战

(1)原料供给的挑战

第一代燃料乙醇使用玉米、甘蔗和马铃薯等糖/淀粉作物作为原料,但其大规模生产对食物供应构成威胁,因此引发了“与人争粮,与粮争地”的问题。为了解决这一问题,人们开始以农业废弃物和木质纤维素材料为原料生产二代燃料乙醇。尽管(转基因)藻类也可作为原料来生产生物能源,但由于藻类的收获困难和前期成本昂贵,现在还无法实现大规模生产。相比之下,二代燃料乙醇具有原料成本低、来源广泛、投资成本也较低且对环境的影响小等优点。

近年来,各国陆续建设了纤维素燃料乙醇生产的示范项目 预计二代燃料乙醇工艺有望使美国乙醇年产量增加1倍,巴西乙醇年产量增加3倍以上,可见,未来二代燃料乙醇有望完全取代一代燃料乙醇。

(2)生产工艺的挑战

为了能够与石油的成本相竞争,需要提升燃料乙醇生产工艺中 原料转化为糖的技术 。在纤维素乙醇生产过程中,工业友好的预处理方法以及后续的酶水解是资本密集型的步骤。

预处理通过破坏植物细胞壁致密结构以提升纤维素和半纤维素的可消化性,再通过纤维素酶的协同作用进而释放出糖分子。然而,这些酶在水解过程中面临非生产性结合、酶抑制和反应速率低等问题,使酶解效率和糖产量都降低。

因此,降低酶的使用量和成本是一个不可避免的任务,需要寻找更经济高效的酶水解方法或开发更具成本效益的酶。 此外,微生物利用可发酵糖进行发酵生产乙醇的工艺也至关重要。通过工艺流程优化或菌株改造来提高发酵效率或实现对木糖的转化,对于木质纤维素精炼具有重要意义。

在这里,团队主要综述几种先进生物技术对纤维素燃料乙醇发展的推进作用以及未来的发展前景。

02

推动纤维素燃料乙醇高质量发展的先进生物技术

随着科学技术的快速发展,近年来已经开发出诸多先进的生物技术来推动燃料乙醇的高效生产发展,将从以下4个方面(图1)进行具体阐述。

图1 推动纤维素燃料乙醇高质量发展的先进生物技术
(1)发酵工艺优化策略
发酵工艺对燃料乙醇生产的重要性不容忽视。 木质纤维素原料经过预处理被转化为可发酵糖的过程会产生很多抑制物。 根据预处理工艺的不同,其产生的抑制物类型也有差异 :水热法预处理会产生酚类、呋喃和羧酸;酸法预处理会产生乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF);碱法预处理会产生甲酸、乙酸和酚类物质;机械研磨法会产生酚类和糠醛。这些物质对酶活性及发酵微生物的性能产生负面影响,可能引起乙醇产量降低甚至完全抑制乙醇生产。
在传统的生物加工工艺中,分步酶解发酵(SHF)以及同步糖化发酵(SSF)被广泛采用(图2),而现在开发了统合生物加工(CBP)工艺,表1总结了这3种加工工艺的优缺点。SHF工艺是根据木质纤维素生物转化多步骤的需要,结合现有技术的最直接的策略,将每个步骤在最佳条件下进行。但是SHF工艺存在水解酶的反馈抑制问题,这是因为水解产生的高浓度糖对酶以及发酵微生物产生渗透应激,最终影响生产性能。 由于能源需求高、酶成本昂贵以及操作成本高,SHF工艺的工业应用受到限制。
表1 不同纤维素乙醇发酵工艺的优势及局限性
图2 生产纤维素乙醇的方法
SSF工艺整合了酶解和发酵步骤,由于这两个步骤是在同一个生物反应器中进行,因此,糖一旦被释放出来,它们就会被转化为乙醇,从而避免糖在抑制水平上的堆积。然而,大多数微生物生产生化产品和生物燃料的最适生长温度是中温,而水解木质纤维素的理想温度超过50℃,因此仅适合嗜热微生物发酵工艺。此外,还包括优化水解和发酵工艺参数、解决发酵抑制剂等方面的挑战。
为了克服这些限制,统合生物加工(CBP)工艺提供了一种可持续的策略,即将酶生产、酶解和发酵这3个步骤整合到单个或一组微生物中进行。利用CBP工艺可以减少或消除外源添加酶的需求,并通过在一个容器中同时执行所有步骤来提高效率。
然而,目前存在一个限制,即缺乏高效CBP微生物。 尽管已经开发了一些非常规微生物作为CBP宿主来生产乙醇,但是只有酿酒酵母因其高乙醇生产率和遗传适应性能作为CBP工艺的理想宿主。通过调节酿酒酵母中纤维素酶的表达和拓展酵母可利用的底物谱,将酿酒酵母改造为CBP工艺的宿主是减少对不可再生石油基化石燃料依赖的最有前景的方法之一。
(2)代谢工程策略
利用木质纤维素生物质高效生产生物燃料主要取决于寻找和开发适合整个发酵工艺的微生物。 纤维素乙醇生产的理想菌株应该具备能够完全利用由木质纤维素生物质原料产生的戊糖和己糖,承受高温和低pH,对抑制物和乙醇表现出良好的耐受性以及对乙醇合成具有高代谢通量的能力。
代谢工程是一个热点的研究领域,它有助于针对性地重新连接细胞代谢,以提高目标代谢物的浓度、速率和产量。代谢工程在细胞工厂的开发中得到了广泛应用,是设计代谢底盘以目标宿主生产生物燃料的必要条件。目标酶的过表达、基因部件工程、辅因子工程、异源基因表达及竞争途径阻断等代谢工程方法是提高产量的关键解决方案。酿酒酵母作为应用最广泛的细胞工厂之一,是代谢工程改造的首选,因为针对它已开发出多种遗传工具和大量可用的组学数据库。
为了达到生物燃料生产的最高产量,必须克服的关键问题是增强菌株对抑制性化合物、代谢中间体和所需最终产品的耐受性。 微生物细胞的生长对于增加生物燃料产量是非常重要的,因此必须设计具有高耐受性的强健菌株,才能实现燃料乙醇生产的高效率和可持续工业化,这可通过理性工程和自适应进化工程来实现。
理性工程涉及直接操纵已知的遗传成分,如转录调节子、转运蛋白和已识别的途径酶。自适应进化工程则通过适应或诱变导致菌株进化,然后使用高通量方法筛选出具有高耐受水平的菌株。利用系统生物学技术,可以揭示产生增强菌株耐受性所涉及的因素,再进行遗传开发赋予菌株所需的耐受表型。
由于酿酒酵母天然不能利用木糖,导致木质纤维素水解产物中糖的利用不完全,这是纤维素乙醇生产效率较低的问题之一。尽管酿酒酵母不能将木糖转化为乙醇,但在木糖异构酶(XI)存在的条件下,木糖被转化为木酮糖,而木酮糖可以被酿酒酵母转化利用。 因此通过挖掘、改造出具有高活性的木糖异构酶十分重要。
(3)固定化策略
1、细胞固定化
对纤维素乙醇发酵的细胞固定化方法主要有5种,分别是吸附法、包埋法、膜隔离法、交联法和絮凝法 原则上,使用固定化细胞的连续过程比间歇过程需要更小的反应体积,可以降低成本。固定化已被证明可以提高反应器的生产效率,有助于细胞与液体产物的分离,并促进系统长时间的连续运行。大多数乙醇生产工艺都受到乙醇生产效率低和回收率低的限制以及与所使用的微生物有关的分离问题。在连续系统中,利用固定化细胞可以使生物反应器内细胞密度更高,进而增加乙醇产量并降低生产成本。
此外,当存在抑制剂时,与游离形式相比,多种模式下的固定化细胞都表现出更好的性能。因此,当培养基中存在抑制剂时,细胞固定化已被证明是一种快速且简便的应用策略,可以保护细胞并有助于纤维素乙醇的生产。 细胞固定化为纤维素乙醇生产带来了许多优势,包括工艺稳定性、高生产效率、改进污染物控制以及改善的抗抑制剂性能等。 细胞固定化由于存在更高的传质限制,细胞形态、代谢和生理特性的改变,细胞的异质分布,成本高等缺点,其大规模的工业应用还远未成为现实。 未来针对更多其他载体(如生物炭或多物种生物膜)的深入研究将会给燃料乙醇生产带来更大的工业潜力。
2、纤维素酶固定化
纤维素酶固定化是一种将纤维素酶固定在载体上的技术,在生物燃料、纸浆和纤维素降解等领域的具有广泛潜力。 固定化酶技术可以给酶提供更好的保护,提高酶的稳定性,降低酶的失活率,并使酶在不同温度和pH条件下保持较高的催化活性和效率,操作更灵活和重复使用性高,从而促进可持续能源生产和资源回收。常见的载体包括多孔材料、凝胶、微胶囊和纳米颗粒等。
总之,纤维素酶固定化技术为纤维素降解和生物燃料生产提供了一种经济可行的方法。 随着对固定化酶系统的深入研究和技术改进,实现更高效、稳定和可持续的纤维素降解过程,能够为可再生能源领域的发展做出更大贡献。
(4)酶工程策略
以可再生和可持续的方式,使用定制的纤维素酶混合物来水解木质纤维素生物质,这在能源和增值化学品等生产方面具有巨大的潜力。 为了使生物催化剂的使用在工业上更加经济可行,需要对生物催化剂进行定制,使其能承受温度、pH和盐度等恶劣的工艺条件。
酶工程技术是通过改造酶特性进而推动燃料乙醇发展的一个重要研究领域。利用基因工程和生物化学方法,酶工程技术可以改变酶的结构和功能来提高燃料乙醇的生产效率和质量,从而推动燃料乙醇产业的可持续发展。
其中,定向进化和(半)理性设计是酶工程技术中改善酶特性的强大技术。如:通过设计纤维素酶的催化位点和底物入口来提升酶活性;利用序列比对、折叠自由能分析[68]和B因子引导方法进行合理设计来提高纤维素酶热稳定性;通过定向进化和电荷工程提高纤维素酶在非常规溶剂(离子液体、高盐浓度、有机溶剂)中的耐受性和pH稳定性等。
每种纤维素酶在纤维素降解中都有着特定的作用,利用蛋白质工程可改善纤维素酶在工业应用中缺乏的特性 (活性、热稳定性和pH稳定性)或将纤维素酶的应用扩展到更为复杂的酶解环境中 。在这方面,有必要注意到,高通量筛选平台的开发及应用是纤维素酶定向进化的瓶颈。
目前,随着人工智能技术(AI)的迅速发展,酶工程技术与人工智能的有效结合为该领域带来了许多新的机遇和挑战。
首先,人工智能可以在酶的设计和优化中发挥重要作用 。通过机器学习和深度学习算法,可以分析大量的酶结构和功能数据,以预测新酶的性能并进行合理的设计。 其次,人工智能可以帮助预测和优化酶的反应条件和催化机制 。通过建立模型和算法,可以对酶催化反应的动力学和热力学进行准确预测,以优化反应条件和提高反应效率。这种预测能力对于酶催化的燃料乙醇生产过程的优化非常重要。 最后,通过分析大规模的基因组和代谢组数据,人工智能可以揭示酶与代谢途径的关系,从而指导燃料乙醇生产的优化和调控 。因为相关算法可以帮助识别潜在的酶基因和代谢途径,进而设计更高效的代谢工程策略。
综上所述,通过人工智能在酶设计、反应条件优化和代谢工程中的应用,可以提高燃料乙醇的生产效率和质量,促进可持续能源的开发和利用。随着酶工程和人工智能技术的不断进步,研究人员将获得更多创新成果和技术突破以推动燃料乙醇等生物产业的发展。
03
结论与展望
选择合适的预处理方法 是提高酶解效率的首要前提 ,从商业化角度来说,高效且经济的预处理必须满足减少水用量和降低能源需求、减少抑制剂的产生、实现低成本的催化剂回收和减少废物产生等要求。
预处理之后的酶解步骤成本占纤维素燃料乙醇生物精炼厂总成本的近 25%,酶工程技术的快速发展可以加速实现所需酶特性的提升从而极大地减少酶的用量。 因此,需要寻找合适的宿主并通过基因编辑来调整酶产量以经济生产高效的酶混合物,进而将纤维素生物质原料转化为可发酵糖,最终供微生物生产燃料乙醇和其他高值化学品。
微生物是燃料乙醇生产的主要参与者,因此微生物代谢工程对于生物燃料生产行业的进步是不可或缺的,通过代谢工程可以增加微生物的耐受性、利用底物的能力、提高代谢通量、设计新的代谢途径。 为了实现这些目标,研究人员必须开发全基因组测序、生物信息学、系统生物学、蛋白质组学和代谢组学等新技术来充分了解酿酒酵母或非常规微生物中的重要代谢途径并确定相关的酶。 再通过利用计算工具和先进技术进行微生物的筛选和代谢途径改造,最终以提高纤维素燃料乙醇的工业生产效率,降低生产成本。
如今,随着各种先进生物技术的发展,纤维素乙醇工艺的各个单元(预处理、酶解、发酵等)效能都得到了有效的提升,但是如何将各种工艺技术集成到一个乙醇工程中也是一个重大挑战。由于CBP工艺对于微生物菌株的要求极高,一种将酶生产和糖化步骤整合的综合生物糖化(CBS)工艺被提出。该方法将发酵步骤分开,可以利用生产的糖来生产除了燃料乙醇之外的其他增值产品。当然,CBP或CBS工艺在商业规模上的实现需要高活性稳健催化剂的存在。未来,也需要越来越多的实验室规模研究转向工业规模的放大研究,以评估这些工艺在工业生产中的可行性,最终实现具有经济效益的燃料乙醇规模化生产。
来源:《生物加工过程》

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