国家纳米科学中心聂广军团队，1周连发2篇Nature大子刊！

细菌源纳米囊泡通过训练免疫增强肿瘤疫苗效果

肿瘤疫苗作为一种治疗方法，通过激发特异于肿瘤突变产生的抗原的T细胞来识别和消灭肿瘤细胞。然而，有效的抗原呈递对T细胞的影响至关重要。为了提高肿瘤疫苗的效力，目前的方法主要集中在疫苗配方方面，包括使用免疫佐剂和纳米载体。然而，最新研究表明，先天免疫细胞的效力在不同情境下是可变的，并且训练免疫可能是一个潜在的策略，通过长期功能重编程来增强免疫细胞的响应性。

相关进展： 12月1日，国家纳米科学中心聂广军、李素萍，最新Nature Reviews Cancer！

图1 | OMV的先前给药增强了肿瘤疫苗接种效果。

【OMV诱导了抗原呈递细胞的转录组改变】

研究使用转录组测序分析了在经过OMV训练的小鼠中，淋巴结中树突状细胞（DCs）和巨噬细胞（Mφs）在肿瘤疫苗后的基因表达情况。结果显示，在经过OMV训练的小鼠中，与对照组相比，DCs有256个转录本上调表达和27个转录本下调表达，而Mφs有496个转录本上调表达和169个转录本下调表达。进一步的基因本体（GO）富集分析显示，OMV训练小鼠中上调表达的基因富集在多个与免疫相关的通路，包括补体激活、体液免疫反应、对细菌的防御反应、适应性免疫反应、淋巴细胞激活的正调节、免疫反应激活信号传导、抗原结合和细胞因子产生的正调节等方面。此外，在经过OMV训练的小鼠中，DCs和Mφs中表达与先天免疫激活和抗原呈递相关的基因明显增加，包括抗原处理和呈递、共刺激信号、细胞因子和趋化因子等。这些结果表明，先前给予OMVs可以广泛增强对后续肿瘤疫苗的先天免疫反应。

图2a–c |经过OMV训练的小鼠在随后肿瘤疫苗接种后树突状细胞的转录组变化：OMV训练小鼠中树突状细胞与对照小鼠中树突状细胞的差异基因表达。

【OMV诱导了祖细胞的表观遗传变化】

研究表明，OMVs在祖细胞水平上诱导了显著的表观遗传变化和细胞谱系转变，这是训练免疫的关键特征之一。在实验中发现，经过OMV训练的小鼠骨髓中的造血干细胞和髓样祖细胞的特定亚群显著增加，其中多能祖细胞（MPPs）和粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs）比例增加，而共同髓样祖细胞（CMPs）比例减少。这些变化导致了髓样细胞系的明显转变，加强了GMP的分化，特别是朝向单核细胞和经典树突状细胞（cDCs）的分化。此外，OMVs还引发了骨髓中开放染色质区域的差异性，与免疫相关的基因表达有关。这些表观遗传上的改变和谱系转变在外周抗原呈递细胞（APCs）中持续存在，提高了这些训练后的APCs对于后续肿瘤疫苗的免疫应答。进一步的实验证明，通过对骨髓进行转移实验和外周DCs的再生清除实验，增强的免疫应答主要归因于OMVs对骨髓祖细胞的训练免疫，这些祖细胞在外周不断分化为训练后的APCs。

图2d–i |由于OMV的预先给药而导致的造血祖细胞的谱系转变和表观遗传重塑：在OMV给药后7天骨髓中造血和髓样祖细胞亚群的内容分析，其中对GMPs进行了ATAC-seq排序。j–k，关于OMV对骨髓嵌合模型的免疫动员效应分析：骨髓嵌合模型的示意图说明。

【OMV通过IL-1β诱导了骨髓造血的变化】

研究发现，OMVs经腹腔注射后迅速被先天免疫细胞摄取，但并非直接进入骨髓。这表明某种介质介导了OMV对骨髓造血祖细胞产生的远端影响。在OMV预先给予后，血清中多种炎症因子的水平显著上升，包括白细胞介素-1β（IL-1β），它是已知的内源性训练免疫诱导剂。IL-1β的骨髓细胞外液浓度也在24小时内迅速增加。多项研究表明IL-1β在诱导训练免疫中发挥关键作用。为了探究IL-1β在OMV给药后诱导训练免疫中的作用，研究使用了IL-1受体拮抗剂（IL-1RA，拉仑肽）来研究IL-1β在造血祖细胞谱系转变中的作用。实验结果显示，包括白细胞分化偏向在内的OMV诱导的变化被IL-1RA显著逆转。在IL-1β中和抗体的使用也具有相同的抑制作用。当阻断IL-1受体时，OMV训练后小鼠对后续肿瘤疫苗的反应性显著降低。这些数据表明，IL-1β在OMV引发的骨髓造血变化和后续肿瘤疫苗诱导的训练免疫效应中起着重要的介质作用。

图3 | OMV通过刺激IL-1β的分泌诱导了骨髓造血的变化。

【OMV通过NLRP3炎症小体信号通路诱导了IL-1β的产生】

研究表明，IL-1β的产生需要两个关键步骤：一个“引导步骤”，包括由PAMPs诱导的模式识别受体激活引起的前白细胞介素-1β原基因的转录上调，和一个“激活步骤”，在该步骤中，前半胱氨酸蛋白酶1成熟为半胱氨酸蛋白酶1，通过炎症小体的激活，随后进行IL-1β的蛋白水解成熟和分泌。为了研究OMVs如何参与诱导IL-1β的产生，首先在体外培养中检测到了大量含有骨髓来源树突状细胞（BMDCs）和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的培养液中的IL-1β，这些细胞用于与OMVs进行刺激，并通过ELISA测定其含量。与OMVs强烈激活多个Toll样受体一致，OMVs触发了NLRP3炎症小体反应，表现为凋亡相关斑样蛋白包含CARD结构域（ASC）斑点的明显形成以及NLRP3和剪切的半胱氨酸蛋白酶1蛋白表达的上调。使用MCC950或VX765分别抑制NLRP3炎症小体组装或半胱氨酸蛋白酶1明显减少了体外OMV诱导的IL-1β分泌。

图4 | OMV通过NLRP3炎症小体信号通路诱导了IL-1β的产生。

【OMV通过将LPS输送至细胞质来激活炎症小体】

脂多糖（LPS）是OMVs外膜表面上最有效的PAMPs之一。虽然LPS不能直接激活典型的NLRP3炎症小体，但可以激活与半胱氨酸蛋白酶11相关的非典型炎症小体，影响K+的流出，从而激活典型的NLRP3炎症小体。实验中评估了OMVs在体外培养的BMDCs和BMDMs中传递的LPS的存在，并观察到随着时间的推移，LPS的量逐渐增加。此外，在OMV处理的BMDCs中观察到了细胞质中LPS的存在，而在游离LPS处理组中未观察到。这些数据表明OMVs是将LPS传递到细胞质的有效载体。OMVs触发了半胱氨酸蛋白酶11的蛋白水解成熟，证明了OMVs作为纳米颗粒载体将LPS传递到细胞质中，刺激炎症小体激活和IL-1β的产生。与使用游离LPS不同，预先使用OMVs对后续肿瘤疫苗的响应性有所增强，而LPS预先处理未对肿瘤疫苗的效果产生提升。这些结果再次强调了OMVs将LPS传递到树突状细胞和巨噬细胞的细胞质中，激活半胱氨酸蛋白酶11，进而促使后续的IL-1β产生和训练免疫介导的疫苗增强效应的重要性。

图5 | OMV通过将LPS输送至细胞质来激活炎症小体信号通路。

【OMV提高了肿瘤疫苗的抗肿瘤效果】

这段内容描述了先前给予OMVs对后续肿瘤疫苗的抗肿瘤效果产生的影响。研究首先在肺转移B16-OVA肿瘤模型和皮下MC38肿瘤模型中评估了OMVs预先给药对后续肿瘤疫苗的抗肿瘤效力的影响。结果显示，OMVs预训练的小鼠相比对照组在抑制B16-OVA肺转移和MC38皮下肿瘤生长方面，其治疗效力显著提高。此外，OMV预训练的动物在肿瘤疫苗后产生更多的特异性T细胞反应，并且其脾细胞对靶细胞的细胞毒效应更强。同样，经OMVs预训练后，肿瘤浸润的CD8+ T细胞数量也增加。研究还评估了该免疫策略对免疫记忆的影响，发现OMVs预训练的小鼠在挑战后表现出更强的长期抗肿瘤效应和更长的存活时间，暗示其具有更强的长期抗性。

图6 | 基于OMV诱导的训练免疫的免疫动员示意图，以增强肿瘤疫苗接种效果。

【小结】

总之，该研究显示，在肿瘤疫苗之前给小鼠进行腹腔注射细菌OMVs，在训练免疫的作用机制下，显著增强了抗肿瘤免疫力。由于其天然的纳米结构，OMVs被腹腔内的先天免疫细胞内吞，并伴随着病原相关分子（尤其是内毒素LPS）进入细胞质，激活炎症小体信号通路以诱导IL-1β的分泌。IL-1β进入骨髓导致了造血祖细胞的谱系转移和表观遗传重塑，最终使得分化的外周抗原呈递细胞对后续肿瘤疫苗表现出增强的响应性。这种使用源自细菌的天然纳米囊泡改变基础先天免疫功能的免疫动员策略，是积极引导疫苗诱导的适应性免疫反应的有前途的方法。