水稻秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇的研究

酿酒科技2010 年第2期(总第188期)-LIQUOR-MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2010 No.2[Tol.188)水稻秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇的研究沈进军1.2,3 ,赵剑锋1.2.3,张顺萍3.4,曹晓华},杨志坚'2,许明(1.农业部海峡两岸农业技术合作中心,福建福州350002;2.福 建农林大学农产晶品质研兖所,福建福州350002;3.福建农林大学生命科学学院,福建福州350002;4.福建农林大学 菌物研究中心,福建福州350002)摘要:研究了培养基起始pH、发酵时间.发酵温度、酵母接种量和吐温80对水稻秸秆同步糖化发酵产乙醇的影响。结果表明,酵母接种量能有效地提高发酵液中乙醇的产率。水稻秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇的适宜发酵工艺条件为:起始pH值为4.0~4.5,培养温度为32C,接种量为12%,发酵时间12~24h。在此条件下,生成乙醇的浓度为1.4 mg/mL,水稻秸秆原料的乙醇转化率达7.02 %。关键词:燃料乙醇; 水稻秸秆; 同步糖化发酵; 哈茨木霉中图分类号:TS262.2;TS261.4;TS261.2文献标识码:A文章编号: 1001-9286<2010)02- 0023-04Research on the Production of Fuel Ethanol by SimultaneousSaccharification and Fermentation of Rice StrawSHEN Jin-jun", ZHAO Jjan- feng'2, ZHANG Shun-ping3^ ,CAO Xiao-hua;,YANG Zhi-jian'2 and XU Ming(1. CrosStrait Agricultural Technology Cooperation Center ,Ministy of Agriculture, Fuzhou, Fujian 350002 ;2. AgriculuralProduct Quality Institute , Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou, Fujian 350002 ;3. College ofLife Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou, Fujan 350002;4. Mycological Research Center,Fujan Agriculture and Forestry University , Fuzhou,Fujian 350002, China)Abstract: The efeets of dfferent conditions incuding initial pH value of culture medium, fermentation time, fermentation temperature, and yeastinoculation quantity and Tween-80 on simultaneous saccharification and fermentation of rice straw to produce fuel ethanol were investigated. Theresults showed that yeast inoculation quantity could effectively increase ethanol yield in fermenting liquid. Under the optimum fermentation con-ditions (nitial pH as 4.0~4.5, fermentation temperature at 32 C, and yeast inoculation quantity was 12 %, and fernentation time was 12~ 24 b),the produced ethanol content was 1.4 mg/mL and the conversion rate from rice straw to ethanol was 7.02 %.Key words : fuel ethanol; rice straw; simulaneous saccharification and fermentation; Harianum Trichoderma以非粮食与经济作物为纤维素原料的生物燃料乙醇皮,葡萄糖20g,琼脂粉20g,用水定容至1L。生产是决定未来大规模替代石油的关键。我国是农业大基础固体产酶培养基:稻草粉4g,麸皮1g,无机盐国,每年可产生秸秆7亿多t,相当于315亿t标准煤,但培养液15mL(KH2PO,4g/L,NH)zSO416g/L,Mg-目前大量秸秆就地焚烧既污染环境又浪费能源。因此,在SO41 g/ L)"。我国开发利用秸秆生产燃料乙醇更具有现实意义。而水- -级种子培养基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨5g/L,酵母稻秸秆是我国三大农作物秸秆之一，约占全国秸秆总量膏3g/L,自然pH。的25.10%。因此,研究利用水稻秸秆产乙醇是解决人类二级种子培养基:葡萄糖30g/L,蛋白胨5 gL,酵母粮食、能源、环境三大危机的重中之重,有利于解决秸秆就地焚烧造成的污染和浪费,并可增加农民收入,这符合乙醇发酵培养基;稻草粉2 g,纤维素酶液按20 IU/g我国“三农问题"的需求,也符合我国农业可持续发展与稻草粉加入,酵母菌以10%接种量加入。生态农业发展的需求。.2 菌种哈茨木霉(Harianum Trichoderma);葡萄牙假丝酵母1材料与方法(Candida lusitaniae)。1.1培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:马铃薯200 g、去.中国煤化工秆2g,纤维素酶液按基金项目:省科技创新平台建设计划项目“福建省特种稻创新平台建设"(2007S1YHC N M H G稻育种与综合利用技术研究"(2008N20001-4)。收稿日期:2009-12-17作者简介:沈进军(1983-),男,硕士研究生.研究方向:应用微生物。通讯作者:许明(1978-),男,博士,主要从事特种稻育种与利用研究。23酿酒科技2010 年第2期(总第188期).LIQUOR-MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2010 No.2(ol.188)20 IU/g稻草粉加入，酵母菌以10 %接种量加入,瓶口塞◆乙醇+还原糖橡皮塞(插有针头,以排出生成的CO2)以控制厌氧条件,在不同温度、不同时间、不同接种量、不同起始pH值等.成0条件下进行燃料乙醇发酵的单因子影响试验和正交试0.8验,测定发酵醪液中燃料乙醇的浓度、糖分含量。0.60.441.4酶活力测定方法.0.2滤纸酶(FPA)活力:通常以滤纸酶活力(FPA)代表纤12维素酶的总活力，按照国际理论和应用化学协会(IU-时间(h)PAC)推荐的国际标准方法测定叫,以国际单位IU表示。图1时间对同步 糖化发酵的影响试管中放人1x6 cm whatmanNo.l滤纸(约50 mg)- - 条，接种的酵母数量有限，总代谢速度低于较高的酶解产糖加入0.5mL适当稀释的纤维素酶液和1.5mL柠檬酸缓速度所致。另外,采用的酵母对于底物中复杂的成分可能冲液(pH4.8),于50 C水浴60 min。空白试验中除酶液事需要一定的适应过程才可以发挥作用。在发酵中后期,发先灭活外,其余条件不变。反应结束后用DNS法测定所酵液中几乎没有明显的葡萄糖残余。在起初的24h内，得的还原糖含量。个滤纸酶活力国际单位(FPIU)等于酶促反应中每乙醇浓度一直上升,当培养到24 h,乙醇浓度达到最大,分钟生成1.0μmol葡萄糖(以还原糖表示)所需的酶量。乙醇浓度达1.400 mg/ mL,36h后，乙醇浓度开始下降，因此,发酵时间以24h为宜。则有:滤纸酶活力(FPIU/mL)2.2.2酵母用量对发酵结果的影响在pH值4.8、温度为30C、纤维素酶用量为20FPI-=糖量(mg)X l(min)x 1000(umo/mmoI)x稀释倍数U/g、不同的接种量条件下,48 h内发酵醪液中燃料乙醇180(mg/mmol)x60(min)x0.5(mL)β-葡萄糖苷酶的测定方法有多种D。根据高培基4浓度见图2。(1988)的方法改进,取0.5 mL适当稀释的粗酶液,加入1.5mLpH4.8.0.05mol/L的柠檬酸缓冲液配制的1%的1.0水杨苷,50 C恒温水浴中酶解30 min,立即加入1.5 mLDNS试剂,沸水浴煮沸10min,定容至25mL,于540nm测0D值，并以加热失活的酶液按照同样的方式处理做0.4空白对照。.2在上述条件下,1min水解产生1umol葡萄糖所需0.0364的酶量定义为一个酶活单位(IU)。β-葡萄糖苷酶活力(IU/mL)围2不同酵母用量下 水稻秸秆的同步糖化发酵=糖量(mg)xl(min)x1000(μumo/mmol)图2表明，不同的接种量对水稻秸秆同步糖化发酵180(mg/mmol)x30(min)x0.5(mL).5 乙醇浓度和葡萄糖含量的测定方法生产燃料乙醇有很大的影响，其中在接种量为12 %时，同步糖化发酵过程中，每隔一定时间取发酵液适燃料乙醇浓度最大,为1.3 mg/mL,此时水稻秸秆原料乙量,适度稀释后用生化分析仪分析其乙醇浓度和葡萄糖醇转化率为6.52 %。含量。2.2.3 温度对发酵结果的影响在pH值4.8、接种量为10%、纤维素酶用量为202结果与分析FPIU/g和不同温度条件下，经过48 h发酵,发酵醪液中2.1纤维素酶活 力燃料乙醇的浓度见图3(A.B、C、D、E、F)。于28C,固体培养72h后,经测定，滤纸酶活力为图3表明，葡萄牙假丝酵母作用于水稻秸秆产燃料3.6 IU/g,β-葡萄糖苷酶活力为3.2 IU/g。乙醇具有广温性,在30~ -37 C之间燃料乙醇浓度相差不2.2发酵条件大;30 C时,乙醇浓度最大,达1.3 mg/mL,只是在48h才2.2.1发酵时间对发酵结果的影响达到这一- 最高值;32 C时，乙醇浓度在24 h就达到最大将种子液按10%接种量接种于固体发酵培养基,起值,为1.267 mg/mL;37 C时,乙醇浓度在24h达到最大始pH4.8,纤维素酶用量20 FPIU/g,于30 C培养,每隔值，中国煤化工醇浓度明显开始降低;- -定时间测还原糖浓度和乙醇产量。50,为二级种子液带人的图1结果表明,在发酵的初期,纤维素酶作用于底2.2.4培养基起始pH值对发酵结果的影响乙醉YHCNMHG长呈一直上升趋势。物中纤维素成分所生成的葡萄糖只有少量被酵母利用生成乙醇,发酵液中游离的葡萄糖比较高。这可能是由于所在温度为30°C、接种量为10%、纤维素酶用量为24沈进军赵剑锋，张顺萍,曹晓华，杨志坚,许明●.水稻秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇的研究◆乙醇十还原糖+还原糖网L.51.5“1.0f◆1.00.5.50.022436时间(h)22436A:28 C发酵D:37 C发酵-+乙醇2 2.5[◆厶醇十还原糖:2.0tg 2.0张1.5.0 t◆◆0.5 t.0124836 48B:30 C发酵E:40 C发酵2.0「1.6「◆乙醇十还原糖一还原.41.0◆0.80.5|0.42.12C:32 C发酵F:50 C发酵圉3不同温度下水稻秸秆的同步糖化发酵20 FPIU/g,不同pH值条件下,经过48 h发酵,发酵醪液沈加成门的研究表明,0.2%的Tween-80对于以木中燃料乙醇的浓度见图4。糖渣为底物的SSF有一定的促进作用。早期和最近的研自1.4[◆4.5 +5←5.5究表明，添加表面活性剂能够提高纤维素到葡萄糖的转Y 1.2化率间。Castanon等7研究表明，添加Tween- -80后,48 h的报纸酶解率提高了14 %。但也有在添加表面活性剂后e 0.84作用相反的报道1-9。本实验添加Tween -80对水稻秸秆.6-同步糖化发酵的影响结果见图5。0.2图5结果表明,Tween-80对于SSF作用不明显,总体而言,Tween-80对于水稻秸秆的SSF没有促进作用，24 36仅在发酵的24h,添加0.05 %和0.50 %的Tween-80 对于水稻秸秆的SSF有-定的促进作用,比对照分别提高图4不同pH下水稻秸秆的同步糖化发酵图4表明,发酵液在不同的pH(4.5~5.5)下对水稻”2.3发酵各件的正亦试睑丝果17.90 %和28.62 %。秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇的影响不大，说明水稻中国煤化工基本确定水稻秸秆同秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇在这一pH范围内具有步糖化|YHCNMHG件为:pH值为4.5、温广适性,其中在pH值4.5时发酵醪液中燃料乙醇浓度达度为37C、接种量为12%、发酵周期为24h。为了获得最大,为1.233 mg/mL。最佳的发酵条件，需要对影响燃料乙醇产率的因素进行2.2.5 Tween -80对SSF的影响25酿酒科技2010 年第2期(总第188期).LIQUOR MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2010 No.2(ToL.188◆0. 05%-古- 0.20%*- 1. 00%响来看，各个因子影响燃料乙醇浓度的顺序分别是1.4 +0, 10%* 0. 50%Al=A2> A3.B1> B2> B3、C2= C3>C1.D3> D2> D1,因此可以确定最佳条件组合为AB.C2D3、A.B,CD3、.0 tA.B.CD3 A2B,C.D3,即时间为12h或24h、温度32 C、0.8 tpH4.0或4.5、接种量12 %。.6-③从各因子的极差大小RD> RB> RA= RC可知，0.4 t在发酵条件中,对乙醇浓度影响最大的是酵母用量,其次.2|是温度,而时间和pH的影响是最小的。.0 L236483结论.时间(h)水稻秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇的适宜的发酵围5 Tween-80 对水稻秸秆同步糖化发酵的影响工艺条件为:起始pH值为4.0~ 4.5,培养温度为32 C,优化组合试验。对发酵条件中的时间、温度、pH值和接种接种量为12%,发酵时间12~24 h。在此条件下,生成乙量等4个因素进行了正交试验，试验设计及试验结果见醇的浓度为1.4 mg/mL,水稻秸秆原料的乙醇转化率为表1。7.02 %。表1 Lg(3) 正交实验结果及分析因素乙醇浓度参考文献:实验号A(时间,h) B(温度,C) C(lH) D(接种量，) (/咖_ [1] 徐昶,龙敏南,邬小兵,等. 高产纤维素酶黹株的筛选及产酶条1(12)1(32) 1(3. 5)1(8)1.1件研究[]厦门大学学报(自然科学版)2005,44(1):107.2(37)2(4.0)2(10)1.3[2] Ghose T K.Measurement of cllulase aivitis([]Pure Appl3(40) 3(4. 5)3(12)Chem, 1987 ,59(2):257- 268.2(24)1(32) 2(4. 0)1.4[3]李华，高丽β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展[]食品3(4.5)与生物技术学报,2007,26(2): 107-114.3(40)1(3. 5)[4] 高培基,曲音波, E祖农.纤维素酶解过程的分析和测定[].生3(36)1(32) 3(4. 5)1.物工程学报，1988,4(4):321-325.1(3.5)3 (36)3(40) 2(4. 0)1.0[$] 沈加 成.酶解工业纤维废渣生成乙醇技术的研究[D].济南:山(112. 33312. 66712 00010. 667东大学微生物技术国家重点实验室,2008.12. 333 12. 33312. 667[6] Helle SS,Duss SJB,Cooper DG.ffect of surfactants on cllulose312. 00011. 667 12. 33313. 333hydrolysis(J].Biotechnol Bioeng 1993;42(5)611-7.0. 3331.000 0. 3332. 666[7] Castanon M,Wilke CR.ffects of the surfactant Tween-80 onenzymatic hydrolysis of newspaper[J].Biotechnol Bioeng,1981 ,由表1结果可以看出:XXII:1365-72.①在9个处理的直观分析中,第4个组合条件下燃[8] Kurakake M,Ooshima H,Kato J,Harano YPretreatment ofbegase by nonionic surfactant for the enzymatic hyrolyis([].料乙醇浓度最高,为1.4 mg/mL。从而可以确定第4个组Bioresour Technol 1994 ,49:247 -51.合A2B,C2D,为最佳条件组合。②从各个因子不同水平条件对燃料乙醇浓度的影[9] Kaar WE,Holtzapple M.Benefts from Tween during enzymichydrolysis of com sover[J]Bitechnol Bioeng 1998,59:419 -27.(上接第22页)缩短为36h,酒精度达到了4.7 %vol。eters[J]. 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