酶法测定甲醇酵母发酵液中甲醇浓度

第11卷第2期生物技术Vol 11 No. 22001年4月BIOOTECHNOLOGYApr 2001thus the increase of its stability. It is found that chymotrypsin remained up to 97% of initial catalytic ac-tivity when there have50%v/ ) glycerol and the moderate pressure of 50 MPa in reversed micellesKey words chymotrypsin preserved micelles catalytic and stability effect of pressure ,temperature glyc中图分类号x814.9文献标识码文章编号:1004-311X2001m2-0023-03酶法测定甲醇酵母发酵液中甲醇浓度黄秀东杨红2涨张高峡李树刚于廷和3(1.重庆雨水生物医药研究所重庆400002.重庆大学生物工程学院重庆400043.重庆医科大学医学超声工程研究所重庆400016)摘要闱用醇氧化酶-过氧化氬酶联合的酶促反应法测定甲醇酵母发酵诱导阶段变化的发酵液中甲醇浓度种能够快速測定发酵液中甲醇浓度的方法。测定的最佳浓度范围是0.5%~5%。关键词发酵押醇酵母押醇醇氧化酶甲醇酵母 Pichia pastoris)发酵的诱导阶10om0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解A℃段甲醇浓度的控制非常关键通常只有配备保存备用酶电极才能监控发酵液中甲醇浓度的变化,1.1.2酚溶液:苯酗AR)OOmg, 100ml蒸馏但是酶电极价格昂贵使用寿命有限。而目水溶解。前用于测定酒类甲醇含量的国标方法1.1.3工作液:临使用前将上述1.1.1和〔GB5009.48-85),不论是气相色谱法还是1.1.2试剂酶酚簷等体积混合。亚硫酸品红比色法均需要昂贵或复杂的仪1.1.4甲醇标准溶液器并且还要对样品进行预处理不适合对动态发酵过程监测浓度棵的译配制一系列不同们采用醇氧化酶一过氧化氢酶联合的发酵液将甲釀(工业级加入未诱酶促反应泫简称AOX-CR法)能对成分导阶段的甲醇酵母发酵上清液中配制同复杂而又不断变化的发酵液中甲醇浓度进彳醇水溶液相应浓度梯度甲醇发酵液溶液跟踪测定。无需对发酵液进行预处理在甲1.1.5仪器HP8453型分光光度计。醇浓度为0.5%~5%范围内可对其浓度进1.2方法行快速测定1.2.1原理甲醇等低级醇经醇氧化(A-cohol Oxidase , AoX崖催化生成相应的醛及过材料与方法氧化氢而后者在过氧化氢( Catalase CTR)作用下分解出原子态氧将无色还原型4氨基安替比林与苯酚偶联氧化缩合成红色1.1材料醌亚胺类化合物(最大吸收峰322m和s20进氧化氢海生里)2,內号印醇浓度成正比可用分光先度法是4—氨基安替比林30mg,叠氮钠100mg,用量图1AOXR-CH -OH +o, +Ho+.R-CHO H,O2CH,C=C-NH2cH3C=C·N==02H,O, CH,-N C0+OHCTRCH,N C=o+ 4H.O中国煤化工CNMHG收稿日作者简物技术物理装数撸)男副研究员士从事生24生物技术第11卷第2期1.2.2标准曲线:AOX-CR法分别测定蒸用1%(/)甲醇发酵液作标准溶液。取诱馏水及发酵液中甲醇浓度,研究本方法的可导阶段的发酵液,离心收集上清。按1.2.2行性。按下表中步骤加样混匀,37℃水方法中所述方法进行测定其相应的Am值20min508mm波长测比色绘制标准曲线。按如下公式计算:待测发酵液中甲醇浓度%(v/)=待测样A/1%甲醇标准液A80.181.0%。0.153讨论水溶液醇氧化AOX嘱黄素氧化酶类俗称发酵液乙醇氧化酶FAD是它的辅助因子。该酶能以一系列低级醇、不饱和醇为底物但对支链醇及多元醇不起作用。(1)中的R-CH2OH123456789101112可以是甲醇、乙醇、丙醇等但是以催化甲醇甲醇浓度(%,N的效率最高。(2)中的过氧化氢酶也可用过图1水溶液和发醇液中甲醇浓度与醌亚胺类As吸收值关系性略有改变但对测定影响不明显。在甲醇酵母发酵过程中使用的是工业级的甲醇发诗测甲醇酵中最关键的是甲醇等诱导物的浓度控制标准溶液即使含有杂醇这些杂醇大都可以起诱导作蒸馏水/未诱导时发醇上清液用所以测到的虽然不是甲醇的精确量但基甲醇标准液%M/v)本上可反映诱导物的实际浓度。从浓度-吸0.02光度曲线可知发酵液中的其他成分不对测定123甲醇浓度的实际测定取发酵液离结果产生显著影发酵时诱导阶段甲醇的最适浓度随工程心收集上清用于测定按下表加样方法同菌而异,一般在0.5%~3%之间,这正是1.2.2AOX-CR法测定的理想范围。需说明的准溶液加入物m)空白管(未号导发酵液待是AOX-CTR测得是以甲醇为主的低级醇甲醇至1%)发酵液浓度不是甲醇的浓度它不能取代目前测甲未诱导时的发酵上清液0.02醇浓度的气相色谱法和亚硫酸品红比色法醇标准液1%w/v)附醇氧化酶的制备及活力单位(I0.02定醇氧化酶是甲醇酵母等微生物在以甲醇待测发醇液0.02为唯一碳源时大量合成的一种酶, Pichia pas工作液tors酵母产生的醇氧化酶在该空间结构上有2结果缺陷所以活力较低6U/mg-101/mg酶蛋白)它是以大量合成该酶来实现对甲醇的大量利用的。如果不能购买到商品化的该酶2.1标准曲线可以尝试从GS115Mut+型工程菌或宿主菌根据散点图选择甲醇浓度为0.5%诱导后的菌体中大量提取AOX这种自提取5%的范围的6组数据进行线性回归分析的AOX可用于本方法,同购买 Biozyme的甲醇水溶液组y=0.0195x+0.0036r=A0X没有明显差别。具体提取及活力标定日薛发酶液组=03+09法时美5测列支利(专利号:4430427、09代表甲应体积百分比浓度值(%,参考文献检u1北中国工业出社v)代表对应的A值。从上面的吸收曲线上可见甲醇浓度在[2于海波刘庆河都波酒类、饮料食品及其原料分析0.5%~5%的范围内本法测定的线性关系良好由反应终产物醌类的量可对样品(水溶液或发酵液冲甲醇浓度进行准确测定发酵TH轻T业标准出版委员会,991,7中国煤化工M]成都四川科学技术出CNMHG液中的其他成分对该方法的测定不构成显著culmination of alcohol oxidase and影响。azide compound[ P ] United States Patent 4430427.19842.2诱导阶段发酵液中甲醇浓度的测定及[5]pkis, Alcohol oxidase from pichia- pe yeast[ P]. United计算States patent:4540668.1985-09-10.用诱异煎的发酵液上清液作空白对照并422第11卷第2期生物技术Vol 11 No. 22001年4月BIOOTECHNOLOGYApr 2001thol oxidase[ P]. United States Patent #956290 1990-09Colorimetric assay of methanol in fermentation broth of Pichia pastorisHUANG Xiu- dong YANG Hong? HANG Gao-xia', LI Shu- gangYU Ting-he(I Chongqing Rain Biotech Institute Chongqing 400060 2. Bioengineering Institute ofChongqing University Chongqing 400044 3. Institute of Ultrasound Engineering inMedicine Chongqing Medical University Chongqing 400016)0.5%. isa i ry important to control methanol concentration in broth of Pichia pastoris which isAbstract It was vecomplicated andssant changed. A colorimetric assay was established in this study based upon com-bined catalyalcohol oxidase and catalase. The results showed linear relationship was excellent withinIt was an acceptable method and could determine methanol concentration rapidl图分宾fermentation Pichia pastoris 'methanol alcohol oxidase文献标识码文章编号1004-311X2001)2-0025-03维生素C二步发酵的新组合菌系仲崇斌ψ于海2吕主奎2冯树1张忠泽1.中科院沈阳应用生态所辽宁沈阳1100152.东北制药总厂辽宁沈阳110026)以掷孢酵母作为伴生菌与氧化葡萄糖酸杄菌组成新混菌体系对其产酸性能和特点进行了研。实验室摇瓶结果显示新菌系混菌状态不同产酸不同,以KGA含量为4.8小菌/掷孢酵母为31:l种液接种时最有利于产酸增加接种生物量可提高产酸速度縮短发酵周期但不影响最终产酸量。相同条件下新菌系产酸能力高于现有菌系酸量增加5mg/ml-7发酵周期缩短6h~8h酸转化率提4%最高产酸点H值下降约0.5表现出较大的产酸潜力和可修饰性。关键词vC二步发酵2-酮基-L-古龙酸孢酵母氤化葡萄糖酸杆菌维生素αvc)步发酵的第二步为混菌1.2培养基深采用掷孢酵母、氧化葡萄糖酸发酵使L-山梨糖合成V前体2-酮基-L杆菌及巨大芽孢杆菌适合培养基(3)古龙酸KGA最初筛选的混菌体系为氧1.3分析方法化葡萄糖酸杄菌与条纹假单孢杆菌的组合生长曲线的测定光密度法4前者为产酸菌俗称小菌)后者不产酸但可3.22-酮基-L-古龙酸含量的测定:碘促进前者产酸也称伴生菌宁文珠以巨大量法5芽孢杆菌代替条纹假单孢杆菌获得成功后13.2残糖的测定蔥酮试剂法6经不断改进目前生产上大多使用的混菌体系为巨大芽孢杆菌和小菌的组合使糖酸转2结果与讨论化率已由最初的39.7%(糖浓度7%6d)膿提高到79.5%(2。本文以掷孢酵母为伴生菌与小菌组成新菌系具有较强的抗酸能力酸2.1新组合菌系产酸性能和特点转化率提高发酵周期缩短表现出较大的产将掷孢酵母与小菌按适当比例混合接酸澘力和可修饰性。种28℃振荔(180/min)养每4h取样测定菌浓、酸量、残糖和pH值,得新菌系混菌生1材料与方法长代谢曲线图1)由图可见接种后二菌均有一个适应期发酵前20h内KGA合成较慢相应的L-山梨糖下降速度也很慢这时1.1菌株菌均处于适应期和指数前期发酵20h后1.1.1掷孢酵母( Sporobolomyces roseus),Y4由中科院生态研究所菌种室提供中国煤化工快KGA的积累速度指数期4h左右1.2.巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium)CNMH平KCA积累量达最和氧化葡萄酸杆菌 Gluconobacter oxydans),高以后合成速度变慢基本趋于停滞。发酵2980由东北制药总厂提供。过程中pH值由开始的6.5升到7.8左右随KGA的大量产生pH值又开始下降,直至收稿日期2000-08-05修回日期2001-035.4左右作者简介抻崇-)女讲师硕士现在沈阳农业大学生物事生物技术研究。将新组合菌系与现有菌系发酵特性进行