PCR技术的研究及应用

第30卷第3期长江工程职业技术学院学报Vol 30 No. 32013年9月Journal of Changjiang Engineering Vocational CollSep.2013PCR技术的研究及应用张许文琦(华东理工大学,上海200237)摘要:PCR技术是一种在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。因其较强的特异性和灵敏度以及检测速度快准确性好等优点已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。本文从PCR技术的原理、分类及应用方面进行了综述,并对其发展做出了展望。关键词:PCR技术;水产;微生物中图分类号:Q50文献标识码:A文章编号:16730496(2013)03000404Research and application of PCr technologyZHANG XU Wen-qiEast China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)Abstract: PCR technology is to rapidly amplify certain dna sequence in vitro. Because of its multiple advantages such as strong specificity, sensitivity, quick detection with high accuracy, etc,PCR has been applied to plenty of fields including detecting aquatic products and microorganism.The review of PCR's principles, classification as well as application, and also preview of its futuredevelopment are made here.Key words: PCR; aquatic product; microorganism点,实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增,可0前言在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠,并被世界各分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学,研究和分析,对分子生物学的发展产生了革命性的经过几十年的迅速发展已成为人类从分子水平上真影响。发明人 Kary Banks Mulls也因此荣获1994正揭开生物世界的奥秘,由被动地适应自然界转向年度诺贝尔化学奖2。主动地改造和重组自然界的基础学科。分子生物学的研究内容包含四个方面DNA重组技术,基因表1PCR技术的原理达调控研究,生物大分子的结构功能研究,基因组功能基因组与生物信息学研究。随着分子生物学PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序的迅速发展,相关的研究技术日臻完善,几乎渗透到列、人工合成与该DNA2条链末端互补的2段寡核生命科学的全部领域。本文主要介绍PCR技术苷酸引物,在体外将待检DNA序列(模板)在酶促PCR聚合酶链式反应 Polymerase Chain Re作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个action,PCR)是1985年由美国 PE-Cetus公司的科循环组成,一个循环包括连续的3个步骤学家 Kary Banks Mulls发明的一种可在体外快速第1步是高温条件下的DNA模板变性,即模扩增特定基因或DNA序列的技术。这项新技术是板DNA在93~94℃的条件下变性解链根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特第2步是退火,即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DN中国煤化工退火;收稿日期:2013-0426作者简介:张许文琦(1992),女,武汉人,大学,主要从事环境工程专第3步CNMH(物同时存在业研究的情况下,借助 TaqDNA聚合酶的作用,引物链将张许文琦PCR技术的研究及应用沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链。经过引物的GC含量则应与其类似。一般情况下,设计这个循环后,合成了新链,可将其作为DNA模板继引物时,G+C碱基对含量以40%~60%为佳,解链续反应,由此循环进行。温度高于55℃。避免引物自身形成发夹结构等二循环进程中扩增产物的量以指数级方式增加,级结构,尤其是两个引物之间不应存在互补序列,尤般单一拷贝的基因循环25~30次,DNA可扩增其是在引物的3’末端,即使无法避免,其3’端的互100万~200万倍。PCR反应的步骤很简单但补碱基也不能多于2个,以减少“引物二聚体”的形是具体的操作是复杂的,如退火温度的确定、延伸时成,否则会影响靶DNA序列的扩增。在合成新链间的长短以及循环数等。因此,不同的反应体系应时,DNA聚合酶将单核苷酸添加到引物的3·末端,该确定适当的反应条件,以避免假阴性或假阳性等因此引物3端的5~6个碱基与靶DNA片段的配情况的产生。对必须精确、严格。在PCR反应中,引物的适宜浓度为0.1~12PCR反应基本成分(mol/L)。引物浓度过高,容易形成非特异性扩增,引物浓度过低,不足以完成30个循环,降低PCR的2.1模板DNA产量。通常模板DNA的量较多或高度复杂DNAPCR反应的模板可以是单链或双链DNA,可如人类基因组DNA作模板时,引物浓度应低一些以是基因组DNA或CDNA,mRNA也可作为PCR模板DNA的量较少或低度复杂DNA如质粒DNA的模板,只需用逆转录酶把mRNA逆转录为cDNA作模板时引物浓度应高一些。即可。由于PCR反应的特异性由寡聚核苷酸引物2.3 dNTPs决定,模板DNA不需要高度纯化,但应避免任何蛋dnTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)是PCR白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的反应中靶DNA序列扩增的原料。在PCR反应中蛋白质及多糖类物质的污染。选用纯化的DNA做每种脱氧核苷三磷酸的浓度以50~200gmol/L为模板,可增加模板分子的浓度,除去可能抑制PCR宜,不能低于10~15pmol/L。浓度过高易引起非特反应的杂质如SDS会严重抑制 TaqDNa聚合酶的活性,可显著提高PCR扩增的有效性。通常,模板异性PCR产物,当dNTP浓度高于50mmo/L时还DNA保存于10mmol/ L Tris-HCl(pH7.6)、0会抑制Taq酶的活性;浓度过低则影响扩增产量。mmol/ L EDTA(pH8.0)缓冲液中5。4种dNTP的摩尔浓度应相同,不平衡的浓度会导2.2引物致碱基错配率上升,降低合成速度,导致反应过早终PCR引物是一段与待扩增的目标DNA序列侧1。在10u的标准反应体系中,浓度5mol/L翼片段互补的寡核苷酸片段,长度大多为10~30个和200mo/L的dNTP就足以分别合成6.5g和碱基。通常,一对引物包含5’端与正义链互补的寡Ag DNAL5]核苷酸片段和3端与反义链互补的寡核苷酸片段,24DNA聚合酶这两个寡核苷酸片段在模板DNA上的结合位置之在100的PCR标准反应体系中, Taq dnA间的距离决定PCR扩增片段的长度聚合酶的常用浓度为1~2.5U,人类基因组DNA根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸序作模板时, Taq dna聚合酶的适宜浓度范围为1~列在人类基因组中可能出现的概率为1次。因此,4U。酶量过多会导致增加非特异性PCR产物,反只要引物不少于16个核苷酸,就能保证PCR扩增之会引起PCR产量不足。 Taq dna聚合酶作用时序列的特异性。引物过长往往会降低其与模板的杂需要Mg2,每次扩增反应必须确定最佳Mg2浓交效率,从而减低PCR的反应效率度。 Pfu dNa聚合酶是一种具有高保真性能的高PCR反应成功的关键是设计最佳的引物。引温DNA聚合酶来源于高温嗜热菌,分子量为物设计的先决条件是与引物结合的靶DNA序列必90kDa,适用于一般的PCR反应、基因克隆与表达须是已知的,与两个引物结合的序列之间的靶DNA基因突变分析、全基因合成等。除 Taq dna聚合序列则未必清楚。设计引物时应尽可能选择碱基随酶、 Pfu dna聚合酶外,常见的DNA聚合酶还有:机分布的序列,尽量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他异 Tth dNA聚中国煤化工DNA聚合常序列。两个引物中G+C碱基对的百分比(G+酶, Platium FCNMHGDNA聚合酶C%)应尽量相似,若待扩增序列中GC含量已知时,(高保真)等s013年9月长江工程职业技术学院学报第30卷第3期2.5缓冲液线12。荧光信号在指数扩增阶段,PCR产物荧光信PCR反应的标准缓冲液通常含有10mmol/号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系LTris-HCIe(pH8.3),50mmo/LKCl和1.5mmo/然后进行定量分析1。MGcL2,基本适用于各种模板、寡核苷酸引物,但对3.1多重PCR技术某种模板与引物的特定组合就不一定最佳,用时需多重PCR( multiplex PCr)技术是PCR技术的再作适当调整。种,为同一管中加人多对特异性引物,与PCR管26Mg2+及其它成分内的多个模板反应,在一个PCR管中同时检测多个PCR反应体系中Mg2的浓度十分重要,适宜目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物的Mg2浓度为高于dNTP总浓度0.5~2.5mmol/种的一个片段,也可以同时扩增多个物种的不同片L。当dNTP浓度为0.2 mmol/L时,建议Mg2的段浓度为1mmol/L。Mg2+浓度过高,容易生成非特在同一反应体系中,多重PCR技术进行多个位异性扩增产物;反之,浓度过低会使PCR产量降低。点的特异性扩增时,引物间的配对、引物间的竞争性Mg2的有效浓度受到高浓度的螯合剂如EDTA、高扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面,如果浓度的带负电荷离子基团如磷酸根的影响,它们可能选择适宜的反应体系和反应条件,可极大地提高与Mg2+结合从而降低Mg2的有效浓度。因此,每多重PCR的扩增效果15。主要包括退火温度、退当首次使用靶序列、引物、dNTP(含磷酸根)的新组火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引合时,都要将Mg2浓度调至最佳。通常的方法是物及模板的量等。另一方面,DNA的抽提质量也影设置一组反应,每一反应的KCl(50mmo/L)和Tris响多重PCR扩增效率。如DNA抽提不干净或降HCl(10mmol/L)浓度相同,而MgCl2浓度不同解都将影响PCR扩增效果6)。(0.05~5mmol/L),每次增加(0.5mmol/L),反应3.3单分子PCR技术(SM-PCR)结束后,通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上泳来比较各反应扩增产物的量,从中选出最佳的发展的,基本循环过程相同,但在反应条件、模板数Mg2浓度量、DNA聚合酶选择、引物设计方面具有不同点该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的3PCR技术的分类PCR。单分子PCR技术反应中,DNA模板浓度极低3.1实时荧光定量PCR技术这就要求模板有较高的质量,这是试验成败的决定1996年,学者经过研究,在传统PCR技术的基性因素。在设计引物时,应该严格控制GC的含量础上,首创了实时荧光定量PCR技术,新技术已经和T值,同时尽量避免引物间存在可配对序列。在应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。反应混合物模板数极低的情况下,若引物之间存在实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势,还具少量配对序列扩增时极易形成二聚体,使反应无法有实时性、准确性、无污染,实现了自动化操作和多重进行,得不到所需要的产物。由于单分子PCR技术反应,是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃。反应的变性温度(96~98℃)大多比常规PCR技术荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基(94℃)略高,因而对DNA聚合酶热稳定性的要求团加入到PCR反应体系中,借助于荧光信号,累积也更加严格,需要有较好的热稳定性,以防止温度过实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知高而使其失活。其变性时间(5~15s)、退火时间及模板进行定量分析。实时监测这一特点是常规延伸时间也短于常规PCR技术。PCR技术所不具有的,因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电汰等条件下才能进行无法对起始模板进行4PCR技术的应用准确的定量,而荧光定量PCR技术的反应进程可以4.1PCR技术在水产上的应用根据荧光信号的变化做出准确的判断0-1。一个基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同PCR循环反应结束之后,定量PCR仪可以收集1组织中的表达中国煤化工处理过程中个荧光强度信号荧光信号强度的变化可以反映产的影响而出现CNMH学者应用real物量的变化情况这样就可以得到1条荧光扩增曲 time PCr技不饼旯咴水化合初量对翘嘴红鲍张许文琦PCR技术的研究及应用糖代谢酶G6Pase、GK以及 PEPCK表达量的影表达差异[D曲阜:曲阜师范大学,2011响13-),研究结果可为翘嘴红鲐饲料配方中的最合[4]常世敏PCR在食品微生物检测中的应用邯郸农适糖含量提供理论依据。孙淑娜等2研究叶酸拮业高等专科学校学报,200,.1(4):2325.抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2[5]郑景生吕蓓.FCR技术及实用方法[J].分子植物育种,2003,1(3):382.表达的影响,表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发[6] Krawetz S. A,PonR.T., and dixon g,H,lh育影响较大,可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形 creased efficiency of the Taqpolymerase catalyzed polymerase态异常,并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2 b chain reaction, Nucleic Acids,Res,1989,17,819及HAS2的表达,这可能是叶酸生物学活性受抑后[7]金冬雁等(译),分子克隆实验指南(第二版北京:科导致心脏发育异常的机制之一。 Sawyer et al2以学出版社,19934+342.5657,.7262斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料,[8] KUBISTA M, ANDRADE J M, BENGTSSON M,etal. The real-time polymerase chain reaction [JJ. Molecular采用实时荧光定量PCR技术,检测了P450 aroma Aspects of medicine,.00.723):9515和P450 aromA在不同组织的表达量,表明在各组织[9 AGINdOTAN BO, SHIEL P J, BERGER P H. Simul-中均有2种基因的表达,但表达量显著不同,呈现组 taneous detection of potato viruses,PLRv,PvA, PVX and织特异性。PVY from dormant potato tubers by Taq Man real-timeRT4.2PCR技术在微生物检测上的应用PCRD]. J Viral Methods, 2007, 142(1-2): 1-91990年, Bej et a2在利用多重PCR的方法检[10]李丽平.小麦慢锈品种叶片受条锈菌侵入后的木质素合成及调控研究[D].雅安:四川农业大学,2009测了 Legionella类菌种和大肠类细菌,其结果是通[1]薛霜等实时荧光定量FCR技术研究进展及其在过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素兽医学中的应用[门中国农学通报,2010,(7):111标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检[12] SCHUBERT J, FOMITCHEVA V, SZTAINGRET测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物,表 WISNTEWSKAJ. Differentiation of Potato virus y strains u明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客 ing improved sets ofdiagnostic-PCRPCR- primers[J].J VirolMethods,2007,140(1-2):6674.观等优势,优于传统的检测方法243。 Metzger[t3]袁继红实时荧光定量PCR技术的实验研究[J现代Bodden et a1对 PCR-ELISA的方法进行了评价,农业科技,2010,(1322结果显示样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%[14]朱善元生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用[J.黑龙江畜牧兽医,199,(11):21-22.[15]黄银花等影响多重PCR扩增效果的因素[J.遗传5结语2003,25(1):6568PCR技术是现代分子生物学和生物工程技术16陈诺等多重PCR技术在食品微生物检测中的应的灵魂,掌握PCR技术是进人分子生物学研究的钥[17]刘连生常规PCR技术与单分子PCR技术[医学匙。随着现代分子生物学的迅速发展、科学技术的信息,2010,23(11:4379438不断进步,PCR实验方法将变得更加简单、快速、有18]唐永凯等翘嘴红鲍肝脏G6Pase催化亚基的克隆以效。PCR技术正向着简便、快捷、实用、低成本、高及摄食和饲料中碳水化合物对其表达的影响[水产学报,质量、智能化的方向发展同时PCR技术的应用也200.3101453将不断深入到人类涉及的各个方面,甚至进入寻常19]刘波等高碳水化合物日粮对翘嘴红舶生长、GK及 GK mRNA表达的影响[J.水生生物学报,2008,32(1):家庭中47-53在如今的环境保护工作中,生物处理是最常被20]俞菊华,等碳水化合物脂肪对翘嘴红館 PEPCK基运用的方法,利用各种方法,我们可以根据需求去培因表达的影响门].水产学报,2007,31(3):369373育、改造微生物,让它们为我们所用。[21]孙淑娜,等.叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2bHAS2表达下调[J].中国当代儿科杂志参考文献:2007,9(2):159-163[1]覃拥灵.分子生物学技术及其在环境污染治理中的应[ 22] SAWYER S J, GERSTNER K A, CALLARD G Real-用研究进展[J.河池学院学报,2005,25(2):24time pCR analysis of cytochrome P450 aromatase expression in[2]张晶,张惠文张成刚实时荧光定量PCR及其在微zebra fish: gene specific tissue distribution, sex differences, devel生物生态学中的应用[J.生态学报,20025(6):1445- omental programming; and estrogen regulation[J ]. General and中国煤化工71450.[3]谢海燕黑线仓鼠LHR部分序列克隆及组织器官的CNMHG下转第12页)2013年9月长江工程职业技术学院学报第30卷第3期现的较大拉应力,最大拉应力为1.88MPa。工时未按设计要求预留收缩缝,大坝为全年施工,温从以上计算结果来看,大坝坝体主压应力均小控措施也未达到设计要求,再加上1991年和1997于砌体的容许压应力6.0MPa,故满足规范要求。年都遭“低温+高水位”的不利荷载组合。裂缝削弱工况1、工况2、工况5得到的大坝坝体主拉应力略拱的作用且增大了坝体扬压力,导致坝体应力重大于计算拉应力参考值。究其原因,主要是《砌石坝分布。目前两支测缝计测值受气温影响较小,但随设计规范》(SL25-2006)要求按照《混凝土拱坝设计着时间的推移略有增大迹象,应加强观测规范》(SL282-2003)的要求,有限元法计算成果应(3)结构计算分析表明,大坝砌体主应力在各种补充计算“有限元等效应力”,而本计算成果中存在工况下主压应力均满足规范要求,大坝坝体主拉应应力集中现象。通过对应力集中部位的节点应力补力基本满足规范要求。考虑到拱坝的受力特性,其充计算有限元等效应力,可知坝体主拉应力在基本结构安全基本满足规范要求。荷载组合(工况1~工况4)时,小于1.20MPa;特殊荷载组合(工况5)时,小于1.50MPa。故总体计算参考文献:得到的强度结果基本满足规范要求。[1]马福恒,刘成栋.安徽省黄山市毛坦水电站大坝安全综合评价报告[R]南京:南京水利科学研究院,2004[2]程云峰毛坦水电站砌石拱坝裂缝的环氧灌浆[].小4大坝结构安全性态评价水电,2002,(5):15~16[3]砌石坝设计规范SIL25-2006(1)变形观测资料分析表明,大坝坝体位移变化[4]混凝土拱坝设计规范SL28200符合拱坝的一般变形规律,大坝变形整体协调性好。[5]周磊等.毛坦砌石拱坝应力和变形分析[门水电能(2)经分析,坝体裂缝产生的主要原因是坝体施源科学,2009,(3):67~70.·@····················aa·小·····a··,·,·······合·(上接第7页)of virologicalMethods, 2003, 111(2):95-100[23] BF3 A K, MAHBUBANI M H, MILLER R, et al. [25] ZHANG Z D, BASHIRUDDIN J B Quantitative analy-Multiplex PCR amplificationand immobilized capture probes sis of foot-and-mouth disease virus RNa duration in tissuesfor detection of bacterial pathogens and indicators in water of experimentally infected pigs[JJ. The Veterinary JournalJ]. Mol cell probes,1990,4(5):353-365.2009,180(1):130-132.[24] ZHANG Z D, ALEXANDERSEN S Detection of carri- [26] METZGER- BODDIEN C, BOSTEL A, KEHLE J. Sal-er cattle and sheep persistently infected with foot-and-mouth monella sp. PCR-ELISAforanalysis offood samples [J].Jdisease virus by a rapid real-time RT-PCRassay[J] Journal Food Prot, 2004, 67(8): 1585-1590中国煤化工CNMHG