固定化酵母连续发酵乳清粉生产燃料乙醇的研究

酿酒科技2010年第2期(总第188期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No2(Tol18固定化酵母迕续发酵乳清粉生产燃料乙醇的研究郭学武,周珺,刘森,肖冬光(工业微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津30022)对混合固定化克鲁维酵母和固定化酿酒酵母连续发酵乳清生产燃料乙醇进行了研究。结果表明,对比双柱式连续发酵,混合菌株单柱式连续发酵工艺较姸,发酵周期缩短为36h,酒精度达到了4.7%vol。关键词:燃料乙醇;固定化;酵母;乳清粉中图分类号:Q814;TS2611;TS2622;TS2614文献标识码:A文章编号:1001-9286(2010)02-0020-03Research on Continuous fermentation of whey powder by ImmobilizedKluyveromyces marxianus and saccharomyces cerevisiaeto produce fuel ethanolGUO Xue-wu, ZHOU Jun, LIU Miao and XIAO Dong-guang(Key Lab of Industrial Microbiology of Ministry of Education, Tianjin Industrial Microbiology Key Lab,College of Biotechnology of Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300222, China)Abstract: Continuous fermentation of cheese whey powder (CWP)by immobilized Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae toproduce fuel ethanol was studied. The results showed that single-column continuous fermentation by mixed strains was better than double-columncontinuous fermentation(it could shorten fermentation period to 36 h and alcolicity could reach up to 4.7 %vol ).Key words: fuel ethanol; immobilized; yeast; whey powder乳清是乳制品企业利用牛奶生产干酪时所得的一种1.12试剂天然副产品,其主要成分有乳糖乳清蛋白、矿物质等,具乳清粉:地球牌甜乳清粉,天津奥凯化工贸易有限公有很高的营养价值。近年来,关于如何利用乳清的问题一司;海藻酸钠:上海化学试剂厂;氯化钙:天津市凯通化学直是研究的重点。目前已经有一些关于利用乳清生产乙试剂有限公司。醇、单细胞蛋白、沼气等的研究报道1.2种子培养基但是,利用乳清生产乙醇存在乙醇得率低(2%volYEPD;发酵培养基:乳清粉水溶液:乳清粉12%3%vl)、分离成本高等问题。乳清粉是乳清浓缩干燥(wv),pH6.0,于110℃,20min灭菌。初始糖浓度为的产物,其相比乳清来说具有营养物质浓度高、可长期100g稳定放置等优点,是一种较好的替代乳清生产乙醇的1.3酵母细胞的固定化方法原料S。笔者已经报道过关于固定化酵母发酵乳清的研参考文献[6],并根据各试验需要,选择各自所需细究,本文进一步对固定化酵母连续发酵乳清粉生产乙胞浓度。醇进行研究,现将结果报道如下。4酵母细胞的增殖培养1材料与方法将制备好的固定化酵母凝胶颗粒接入到YEPD中30℃活化24h。1.1材料1.5实验方法1.L.1菌种固定化细胞发酵:将获得的固定化酵母菌液体种子马克思克鲁维酵母( Kluyveromyces marxianus)TY-接入发酵培养基中,30℃、120rmin,进行固定化细胞发13酿酒酵母( accharomyces cerevisiae)AY-5均为本室酵,并根据各试验需要,选择各自所需固定化细胞的浓保存。度中国煤化工基金项目:天津市应用基础及前沿技术研究计划重点项目(09 JCZDJC17900),天03),2009-2010学年天津科技大学实验室开放基金项目资助。CNMHG收稿日期:2009-12-15作者简介:郭学武(1980-),男湖南人,助理研究员,研究方向:现代酿造技术通讯作者:肖冬光(1956),教授、博士生导师xdg@tust.edu.cn郭学武,周珺,刘森,肖冬光·固定化酵母连续发酵乳清粉生产燃料乙醇的研究单柱连续发酵:见图1。首先将发酵液填满发酵柱,通过改变恒流泵的转速改变向柱式反应器内加入并按10%接种量接人增殖好的固定化酵母颗粒,并且通发酵液的流量,最终改变发酵稀释速率,进行固定化酵过恒流泵使柱体内的发酵液按22mI/min的速度进行循母细胞发酵实验,确定最佳稀释率。首先,先将发酵液填环,以提高发酵速度。发酵一定时间后,当残糖含量降低满柱式反应器,并接入酵母凝胶颗粒,先反应一定时间,至2g10mL后,开始以15mLh的流量(即稀释率为当流出的反应液的残糖含量由初始的l0g/100mL降低0025h)向柱式反应器注入新鲜发酵液,通过固定化酵至2g100mL时,开始将发酵液以不同的流量流人柱式母细胞层进行连续发酵。并且每隔4~12h不等的时间反应器,待反应稳定后测定其酒精度及残糖值。恒流泵转段对流出的发酵醪液中的残糖含量、酒精度、PH值和细速与稀释率换算见表1,不同稀释率对残糖含量和酒精胞泄漏数进行测定。度的影响见图3。表1转速与稀释率对照结果恒流泵转速进料速度稀释率平均停留时间(r/min)(h)0150.8150.02540b0. 5r/min-lr/min-0. 8r/min1.5r/min注:1发酵液,2.恒流泵,3反应柱,4进料口,5循环液进料口,6.出料口,7循环液出料口图1单柱式连续发酵示意图双柱串联连续发酵:如图2所示,首先将发酵液填满A发酵柱,并按10%接种量接入TY-13酵母颗粒,并且通过恒流泵使柱体内的发酵液进行循环,发酵3h后,也681224由恒流泵作用使A发酵柱内的发酵液流入已按10%接时间(h)种量装填好AY-5酵母颗粒的B发酵柱。当流出液的残a不同稀释率对残糖含量的影响糖含量降低至2g/100mL后,开始以15mLh的流量向A柱式反应器注人新鲜发酵液,通过固定化酵母细胞层2.5进行连续发酵。并每隔4~12h不等的时间段对流出的发酵醪液中的残糖含量、酒精度、pH值和细胞泄漏数进行测定。0.50.8转速(r/min)圖b不同稀释率对酒精度的影响图3不同稀释率对残糖含量和酒精度的影响网图3a、图3b可知,稀释速率为0025h为佳,此注:L发醇液2恒流泵,3反应柱,4进料口,5取样口,6最终发酵时生成的酒精度较高,且发酵修液中线糖含量较低,反应液出料口,7出料口器的生产能力也达到一定水平。若将稀释率降低为图2双柱式连续发酵示意图0015h,酒精度与残糖含量均比稀释率为0.025h时较优,但优势并不明显,且平均停留时间明显延长,故最终1.6检测方法选择稀释率为0.025h为宜。总糖的测定采用菲林滴定法,乙醇釆用快速氧化22中国煤化工法测定。确定2结果与分析CNMHG,由于发酵液体积仅为600mL,且固定化颗粒密度较髙,易于沉入发酵液的下21连续发酵稀释率的确定层,使得发酵液与固定化细胞接触面积较小,因此,为防酿酒科技2010年第2期(总第188期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No2Toll8表2不同循环速度对残糖含量和酒精度的影响对较低,酒精度也达到相应水平。转速发酵时间(h酒精含量2.3固定化双柱串联连续发酵(r/min)4812243648607296120(%vo)207.86.44.63.22.2般酿酒酵母不能直接利用乳糖需要由克鲁维酵母首先将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖后才能60684.82.90.90.690.480.40.42.441.447利用。由于混菌固定化酵母单柱式发酵,虽然能提806.64.72.70.850.650.460.410.40.40.44.8供发酵液的循环流动,但还不能保证两种酵母的接1006.54.82.60.820.660.470.40.390.380.394.8种时间间隔,因此,还需要再对连续发酵的模式进行探讨,以确定最佳的连续发酵的模式。参照15止发酵液发酵不完全,故通过恒流泵的蠕动使发酵液可的实验方法,对固定化双柱串联连续发酵进行了研究,实以循环流动,以提高发酵效率。恒流泵分别通过20验结果见图4、图4b。r/min、40rmin、60r/min,80rmin和100rmin5个不同的转速提供发酵液的循环流动。乳清还原液按上述实验3.5r+残糖含量→洒精度3内容确定以15mLh的速度向柱式反应器中流加,实验结果见表2。恒流泵转速与发酵液循环速度对照结果见表3。1.5表3转速与循环速度对照结果0.5恒流泵转速(r/in)循环速度(aL/uin02468243640486072961204015a固定化双柱串联连续发酵对残糖含量和酒精度的影响52[D值变化组胞神高数1204.820E+6由表3所知,恒流泵转速在60~-100r/min时对酒精1.5E+06生成量和残糖值影响均不大。因此,综合考虑残糖含量、●·1.0E+06酒精度以及节约能源方面的因素,最终确定恒流泵的转5.0E+05合d速以60r/min为最佳。02468243640486072961202.2.2混菌固定化酵母单柱式连续发酵时间(h)通过2.1.1和2.12.1确定的稀释率和循环速度,用b固定化双柱串联连续发酵对pH值和细胞泄漏的影响15的实验方法,对混菌固定化酵母单柱式连续发酵实验图4分别固定化双柱串联连续发酵结果进行了研究,结果见表4。表4混菌单柱式连续发酵结果由图4的结果分析可知,分别固定化双柱串联连续时间残糖含量酒精度细胞泄漏数发酵实验的平均停留时间为40h,pH值的变化幅度不大(个/mL)且从24h开始一直比较稳定,说明发酵进人稳态后发酵0.05.02.1×105液的酸碱性环境没有太大变化,且对发酵效果影响不大。5.345.02.7X105最终发酵醪液中的残糖含量为0.88g/100mL,而酒精生4.761.24.83.5×1051.44.73.9×105成量为40%vol。这种连续发酵模式虽然可以保证两种81,84.64.0×105酵母接种的时间间隔,但不能提供发酵液的循环流动,导3.44.54.5×105致还有部分糖发酵不完全,使最终的实验结果明显不如0.684.74.36.8×105混菌固定化酵母单柱式连续发酵效果好,因此可以说明,4.888×105增加发酵液的循环流动对混菌固定化酵母连续发酵来说480.484.84.3604.7003.1×10比较重要,既能使发酵液多次重复接触固定化酵母层,还0.4437X10°可以增加一定的氧气供给,对提高发酵速度以及发酵液中的酒精度有一定帮助。由表4中所列出的各项实验指标数值可看出,混菌3单柱式连续发酵实验提高了发酵速度,平均停留时间为中国煤化工36h。pH值变化幅度不大,且从36h开始一直比较稳定,CNMHG002b为最适稀释说明发酵进入稳态后,发酵液的酸碱性环境没有太大变度。刈比告回正化圈休单杜连续发酵和双柱式连续化,且对发酵效果影响不大。发酵醪液中的残糖含量也相发酵工艺确定了单柱式连续发酵工艺较好其发酵周期(下转第26页)酿酒科技2010年第2期(总第188期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No.2(Tol18一0.05%-0.20%1.00%响来看,各个因子影响燃料乙醇浓度的顺序分别1+01000人A1=A2>A3、Bl>B2>B3、C2=C3>ClD3>D2>D因此可以确定最佳条件组合为ABCD3、ABCD3A2BCD3、ABCD3,即时间为12h或24h、温度32℃pH40或4.5、接种量12%。③从各因子的极差大小RD>RB>RA=RC可知在发酵条件中,对乙醇浓度影响最大的是酵母用量,其次是温度,而时间和pH的影响是最小的。3结论时间(h)图5 Tween-80对水稻秸秆同步糖化发酵的影响水稻秸秆同步糖化发酵生产燃料乙醇的适宜的发酵工艺条件为起始pH值为40~45,培养温度为32℃,优化组合试验对发酵条件中的时间温度pH值和接种接种量为12%,发酵时间12~24h在此条件下,生成乙量等4个因素进行了正交试验,试验设计及试验结果见醇的浓度为14mgmL,水稻秸秆原料的乙醇转化率为表1。7.02%。表1L(3)正交实验结果及分析实验号因素乙醇浓度参考文献:A(时间,b)B(温度,℃)C(p)D(接种量%)(mg/毗L)[]徐昶,龙敏南,邬小兵,等高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条1(12)1(32)1(3.5)1(8)l.1件研究[厦门大学学报(自然科学版),2005,44(1):10721(12)2(37)2(4.0)2(10)1.3[2] Ghose T K Measurement of cellulase activities). Pure Appl31(12)3(40)3(4.5)3(12)1.3Chem,1987,59(2):257-268.1(32)2(4.0)(24)2(37)3(4.5)1.13]李华,高丽β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展食品62(24)与生物技术学报2007,26(2):107-11473(36)1(32)3(4.5)2(10)13高培基曲音波,王祖农纤维素酶解过程的分析和测定门生2(37)1(3.5)3(36)3(40)2(4.0)1.0[5]沈加成酶解工业纤维废渣生成乙醇技术的研究[D]济南:山K12.3330010.东大学微生物技术国家重点实验K212.33312.33333312.667[6 Helle SS, Duss SJB, Cooper DG. Effect of surfactants on cellulosK312.00033313.333hydrolysis[J]. Biotechnol Bioeng 1993: 42(5): 611-7.0.3331.0000.3332.666[7] Castanon M, Wilke CR Effects of the surfactant Tween-80matic hydrolysis of newspaper[J]. Biotechnol Bioeng, 1981由表1结果可以看出XxI11365-72①在9个处理的直观分析中,第4个组合条件下燃[8] Kurakake M, Ooshima H, Kato J, Harano Y pretreatment o②从各个因子不同水平条件对燃料乙醇浓度的影 Kaar We,echn019,49:21-omyr料乙醇浓度最高,为14mgmL。从而可以确定第4个组合A2BC2D23为最佳条件组合Holtzapple M Benefits from Tween during enzymic中“+-+-+ hydrolysis of com stover[]. Biotechnol Bioeng 1998, 59: 419-27上接第22页)缩短为36h,酒精度达到了47%voleters[J]. 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