聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸的合成与表征

生物医学工程学杂志 J Biomed Eng2006;23(4):786~789聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成与表征*杜建张晟张丽芳孙蕊熊成东彭宇行(中国科学院成都有机化学研究所,成都610041)摘要以聚乙二醇单甲醚为原料在溶剂中与萘钾反应,形成聚乙二醇单甲醚的钾盐活性中间体,再与对甲苯磺酰氯反应得到聚乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯,进而反应生成氨基聚乙二醇单甲醚并用此引发苄基L谷氨酸N-羧酸酐,生成嵌段共聚物聚乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸,然后用碱脱去苄酯保护基,得到水溶性的聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸。用红外光谱,核磁共振,凝胶渗透色谱对聚合物结构进行了表征该嵌段共聚物在药物控制释放研究中具有重要的应用价值。关键词氨基聚乙二醇单甲醚苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐聚乙二醇单甲醚聚谷氨酸嵌段共聚物 Synthesis and Characterizations of Poly (ethylene glycol)- block-poly (glutamate) Du Jian Zhang Sheng Zhang Lifang Sun Rui Xiong Chengdong Peng Yuxing (Chengdu Institute of Organic Chemistry, Academia Sinica, Chengdu 610041.China) Abstract Amine-terminated poly (ethylene glycol)(PEG) was prepared by two steps. Firstly, potassium naphthalene was added to a solution of methoxypolyethylene glycol 5,000 in benzene until the solution maintains green in half of an hour, then excess tosylchloride was introduced; secondly, the conversion of the tosylate into an amine was carried out by Gabriel synthesis. The block copolymer poly (ethylene glycol)-co-poly (7-benzyl L- glutamate could be obtained by ring -opening polymerization of Y-benzyl-L-glutamate N-carboxy anhydride with amine-terminated PEG as macroinitiator. And the benzyl group could be removed by sodium hydroxide.The product structure was characterized by IR. HNMR GPC. The cisplatin-loaded micelle was observed by transmission electron microscope(TEM). And the block copolymer is expected to be useful as functional materials including carrier systems in drug controlled delivery applications. Key words Amine-terminated PEG y-Benzyl-L-glutamate N-carboxy Poly (ethylene glycol)-co-poly (glutamate acid) Block copolymer1引言要使用有机溶剂,强力搅拌,和表面活性剂。这就使得那些易失活,不稳定的药物不可避免的存在失活,在聚合物科学领域,无论是基础研究还是应用分解变性的现象。而且这类载体往往载药量较低,原研究,通过大分子自组装形成超分子结构的新型功因是药物与载体之间是靠物理吸附和包裹作用结合能高分子都是研究热点之一。在这一领域中嵌段共到一起的。因此近年来人们开始对聚醚共聚物的结聚物,特别是以聚醚为基础的嵌段共聚物引起了人构进行改性,引入带有活性基团的水溶性的链段,其们的特别关注。在聚醚与可生物降解高分子共聚材中有代表性的共聚物为聚醚聚氨基酸两嵌段共聚料研究得最多的是聚醚与可生物降解聚酯的共聚材物本文将在制备和合成方法上进行一些创新料,如聚醚一聚乳酸等1~1。该共聚物能自组装成纳性探索米粒子,但是这种纳米粒子在包裹药物过程中往往2试剂与仪器第4期杜建等聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成与表征787其溶解,石油醚沉淀纯化,干燥;四氢呋喃,苯,1,4-气(过量10%),在60下反应,待反应液变清亮后,氧六环石油醚均先经过预干燥然后用金属钠回冷却至室温,加大量石油醚沉淀,然后用四氢呋喃重流脱水,直至二苯甲酮指示剂变为蓝色蒸出;N,N-结晶三次,干燥,得白色疏松状固体,产率57.4%二甲基甲酰胺,三氯甲烷用五氧化二磷干燥72h,3.3聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成使用前蒸馏;其它试剂均为国产分析纯 NICOLET3.3.1聚乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸两嵌段共聚200 SXV FT--R红外光谱仪,溴化钾压片; Varian物的合成将氨基聚乙二醇单甲醚和苄基L谷 UNITYINOVA--400Hz核磁共振仪,以氘代氯仿为氨酸-N-羧酸酐加入预先用氮气置换过的干燥反应溶剂; Waters Associates Model ALC/GPC244凝瓶中,然后用注射器加入1,4二氧六环和氯仿的混胶渗透色谱,聚苯乙烯为标样,四氢呋喃为溶剂。合溶剂(3:2,v/v),使两种原料的总浓度为5%(wt/v),在35C下搅拌反应72h后,加入大量甲醇3实验部分沉淀得白色固体产物,产率63.2%3.1氨基聚乙二醇单甲醚的制备.3.2聚乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸脱保护将3.1.1聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯的制备乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸配成5%(wt/v)的氯在干燥的充有氮气的反应瓶中加入聚乙二醇单甲仿溶液,加入过量的1mol/L的氢氧化钠水溶液,在醚和苯,待聚乙二醇单甲醚溶解后,加入适量的萘钾室温下搅拌反应30mi,然后用盐酸将溶液pH值直至绿色0.5h不消失,然后加入过量的对甲苯磺调至中性,分液,得氯仿层和水层,将水层溶液用氯酰氯,室温反应24h,抽滤除去氯化钾,用大量乙醚仿萃取3次,然后把萃取液和氯仿层溶液合并加大沉淀得到初产物。初产物再用乙醇重结晶,真空干量乙醚沉淀,真空干燥,得浅黄色固体,产率53%燥,得白色固体,产率92.3%。3.1.2聚乙二醇单甲醚邻苯二甲酰亚胺的制备4结果把聚乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯溶于Nn-二4.1氨基聚乙二醇单甲醚的制备甲基甲酰胺,加入过量的邻苯二甲酰亚胺钾盐,4.1.1聚乙二醇单甲醚对甲苯磺酸酯的制备120C,氮气保护搅拌反应3h,冷却到室温,过滤掉从其氢核化学位移上看,=4.18ppm为对甲苯磺未反应的邻苯二甲酰亚胺钾盐,乙醚沉淀,真空干燥酸酯基旁亚甲基的质子位移,=7.81ppm和得白色固体,产率94.5%。7.38ppm均为对甲苯磺酸酯基苯环上质子的化学3.1.3氨基聚乙二醇单甲醚的制备将聚乙二醇位移,说明羟基已转化为对甲苯磺酸酯,其羟基转化单甲醚邻苯二甲酰亚胺溶于无水乙醇享,加入过量率为97.5%。把原料聚乙二醇单甲醚和产品聚乙二的水合肼回流反应4h冷却至室温大量乙醚沉醇单甲醚一对甲苯磺酸酯做凝胶渗透色谱分析,其淀,抽滤得固体产物。然后将产物溶于水,用氯仿萃数均分子量分别为3385和4002,分子量分布为取3次,萃取液用无水硫酸钠干燥1d,氯仿液清1.06和1.05,该结果证实了在反应过程中分子主链亮后,滤掉硫酸钠,滤液用大量乙醚沉淀得到产物,基本没有发生变化将其用乙醇重结晶3次,真空干燥,得白色固体产4.1.2聚乙二醇单甲醚邻苯二甲酰亚胺的制备物,产率82.5%其核磁共振谱显示:6(-CH2OTs)=4.18ppm消3.2y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐的合成失,取而代之的是邻苯基二甲酰亚胺旁亚甲基的化3.2.1-苄基-L-谷氨酸的合成在单颈圆底烧瓶学位移=5.20ppm,外,苯环的质子位移也由8中加入L谷氨酸,苯甲醇(比L谷氨酸稍过量)和=7.81ppm和=7.38ppm转移至δ=7.92ppm60%的硫酸(与L-谷氨酸等量),在70C减压脱水和=7.71ppm,这说明对甲苯磺酸酯已转化成为情况下反应5h,然后将反应物慢慢倒入内含碳酸邻苯基二甲酰亚胺氢钠的冷水中,不断搅拌,直到无气泡产生为止,在4.1.3氨基聚乙二醇单甲醚的制备在其氢核化低温下使其结晶,将析出晶体过滤收集,用水和乙酸学位移中:属于邻苯基二甲酰亚胺全部都消失了,并乙酯各洗3次,干燥后得白色固体,产率55.9%且在=3.18ppm处出现一个新峰,它归属于氨基3.2.2y苄基谷氨酸-羧酸酐的合成将旁亚甲基的化学位移。红外光谱上也可发现苯环与788生物医学工程学杂志第23卷色谱分析氨基聚乙二醇单甲醚的数均分子量为ppm,ch2=5.12ppm)均已消失,而肽链上氢3360,分子量分布1.08,其结果证实经过一系列反原子的吸收虽然积分面积略有缩小,但变化不大;而应后,聚合物分子量基本未发生变化。且凝胶渗透色谱上仍然只有一个单峰,所测得的分4.2聚乙二醇单甲醚-聚苄酯谷氨酸两嵌段共聚物子量与理论上脱保护后的分子量相差不大,这些均的合成表明苄酯保护基已成功被脱除且聚合物主链基本保从聚乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸的红外谱图持稳定。上可看到:1652cm-()和1548cm-( NH)处肽键的特征峰,1733cm-1的苄酯峰和690cm-1和746cm-1单取代苯特征吸收峰,以及1111cm(u)聚乙二醇单甲醚的特征吸收,这些初步说明产物中聚乙二醇单甲醚组分和聚苄酯谷氨酸组分的存在。然后通过其氢核化学位移得到证实:聚乙二醇单甲醚重复单元中亚甲基质子的特征峰(0-CHCH)=3.41-3.83ppm)聚谷氨酸链段上次甲基氢核的特征峰(C0-CHR-N-H)=4.39ppm),以及苄基苯环上氢核和亚甲基氢核的化学位移(6cH=7.38ppm和ch=5.12ppm)说明产物中ppm86确实存在聚乙二醇单甲醚和聚苄酯谷氨酸链段。最后我们对聚乙二醇单甲醚聚苄酯谷氨酸进行了凝图2聚乙二醇单甲醚聚谷氨酸的氢核化学位移 Fig 2 'HNMR spectral data of MPEG-PGA胶渗透色谱检测,结果发现谱图上只有一个对称流出体积峰(基本没有低分子量级份出现),且分布较5讨论窄,最终证实了嵌段共聚物生成的事实。4.3聚乙二醇单甲醚聚谷氨酸的合成在第一步反应氨基聚乙二醇单甲醚的制备中,在红外谱图中,酰胺在1652cm-1和1549cm-1我们考虑到羟基的反应活性较低,处在大分子聚乙的特征吸收依然存在,而1733cm-1的苄酯峰和69醇单甲醚链端时,其活性不足以引发N羧酸酐开cm-1与746cm-的单取代苯的特征峰都基本消失环聚合需要将其转化为较为活泼的氨基对甲苯磺了,说明脱保护成功(见图1)。酸酯基是一个很好的离去基团,因而我们把聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯用作聚乙二醇单甲醚衍生物的中间体。将聚乙二醇单甲醚转化为氨基聚乙二100醇单甲醚,首先是把其转化成聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯,这步反应的转化程度也决定了最终产8物的氨基化程度,因此制备氨基聚乙二醇单甲醚的60重点和难点就在于制备定量转化的聚乙二醇单甲醚日对甲苯磺酸酯。40聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸酯一般是在碱的20催化下,用聚乙二醇单甲醚和对甲苯磺酰氯反应而得,主要有以下几种方法。(1)以干燥的聚乙二醇单0400333266620001666131000甲醚和过量的对甲苯磺酰氯在二氯甲烷中,用吡啶 Wavenumber做酸吸收剂而得到,但是采用这种方法,羟基的转化图1聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸红外谱图率只有80%,且反应过程中易发生聚合物链的断 Fig I IR spectral of MPEG-PGA裂,反应时间也较长,产物不易纯化。(2)用丁基锂作为碱催化剂来制备聚乙二醇单甲醚一对甲苯磺酸第4期杜建等聚乙二醇单甲醚一聚谷氨酸的合成与表征789会断裂,但羟基转化率又不高。 copolymer interactions for micelle formation: physicochemical本研究的创新之处在于用有颜色的萘钾,可根 characterization. Journal of Controlled Release, 2001: 75:249据颜色来判断聚乙二醇单甲醚的转化程度当逐步eyt. Stolnik, Heald CR,etal. Physicochemical evaluation of nanoparticles assembled from poly(lactic acid)-加入钾时,若溶液维持30min不变色则证明萘钾 poly (ethylene glycol) (PLA-PEG) block copolymers as drug过量,在这种情况下,聚乙二醇单甲醚的末端羟基基 delivery vehicles. Langmuir,20017:3168本完全转化,这点可从其氢核化学位移上得到证实。3 Riley, Stolnik, Garnett MC,etal. Use of viscoelastic而且本方法反应时间短,成本低,产率高,操作简便。 measurements for investigating interparticle interactions in接下来我们进行y苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐 dispersions of micellar-like poly (lactic acid )-poly (ethylene glycol) nanoparticles. Langmuir. 2002; 18: 7663的合成。谷氨酸是一种含有两个羧基的氨基酸,反应 4 Nishiyama N, Yokoyama M. Aoyagi T, et al. Preparation and前需先用苯甲醇保护其中一个羧基,生成苄基-l- characterization of self-assembled- polymer-metal- complex谷氨酸,然后再与三聚光气反应制得-苄基-L-谷氨 micelle from cis-dichlorodiammineplatinum (lI) and poly酸N-羧酸酐。 (ethylene glycol )-poly (-aspartic acid) block copolymer in an随后我们用氨基聚乙二醇单甲醚作为大分子引 aqueous medium. Langmuir, 1999; 15: 377发剂引发y-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐开环聚合。引5H 5 Harada A, Kataoka K. Novel polyion complex micelle entrapping enzyme molecules in the core: preparation of发剂中端氨基的N上有未共用电子对,因此具有亲 narrowly-distributed micelles from lysozyme and polyethylene核性,可通过亲核加成引发链增长生成嵌段共聚物。 glycol)-poly(aspartic acid) block copolymer in aqueous medium.最后脱去聚乙二醇单甲醚-聚苄酯谷氨酸的苄 Macromolecules1998:31:28酯保护基,即得到侧链含有羧基的聚乙二醇单甲醚- 6 Zhou SB, Deng XM. In vitro degradation characteristics of聚谷氨酸。一般的苄酯脱除常使用钯碳催化氢化的poly-- lactide--poly(ethylene glycol) microsphere containing human serum albumin. Reactive and Functional Polymers,方法,但我们在实验中发现:由于钯碳会对聚合物产2002;51(2):93生较强烈的吸附作用,会导致分离困难产率低。考7 Kataoka Ishihara, Harada et al Effect of the虑到聚氨基酸链节中酰胺的稳定性较苄酯强的 secondary structure of poly(l- -lysine) segments on the多,我们采取了碱性条件下室温短时间处理共聚 micellization in aqueous milieu of poly (ethylene glycol)-poly(L lysine block copolymer partially substituted with a物的方法。 hydrocinnamoyl group at the N*-position. Macromolecules,至此我们成功地合成了水溶性的聚乙二醇单甲1998;31:6071醚聚谷氨酸嵌段共聚物。当这种聚合物的水溶液8 Yuan ML, Xiong CD, Deng XM. New sythesis of PEG--Ots与溶于水的药物相混合时,由于有羧基存在,能通过CN98124012.7.1998[明龙熊成东邓先模聚醚对甲苯磺静电吸附、氢键等弱的作用力与药物结合,从而提高酸酯的合成新方法CN98124012.7,1998载药量。因此该嵌段共聚物在药物控制释放研究中(收稿:2004-03-25修回:2004-06-16)具有重要的应用价值。参考文献 I Go vender T. Stolnik S. Xiong CD, et al. Drug-polyionic block