高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究

第30卷第4期三峡大学学报(自然科学版)Vol 30 No 42008年8月J of China Three Gorges Univ( Natural Sciences)高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究何华坤刘莉王红霞晏涛罗希三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443002)摘要:以红薯为原料髙浓度发酵制备燃料乙醇,对各种影响因素进行了实验研究.通过单因素分析和正交实验确定出实验最佳工艺条件为:蒸煮条件:在130℃时蒸煮30min,加水比为水:鮮红薯1:2;液化条件:加入a淀粉酶2%,70℃下液化2h;糖化条件:加糖化酶量2%,60℃下糖化4h;发酵条件:发酵液中KH2PO40.5%、MgSO40.2%、NaCl0.1%、CaCl20.2%、活性物质A2%、活性物质B1%,酵母接种量4%,在32℃发酵20h,34℃发酵52h.关键词:红薯;燃料乙醇;高浓度发酵;酵母中图分类号:TQ517.2文献标识码:A文章编号:1672-948X(2008)04-0067-05Study of Technology of Fermentation of Producing HighConcentration Fuel Alcohol with Fresh Sweet PotatoHe Huakun Liu Li Wang Hongxia Yan Tao Luo XiCollege of Chemistry Life Science, China Three Gorges Univ, Yichang, 443002, China)Abstract The influential factors on fermentation of high concentration alcohol using sweet potatoes as mateal are studied. The optimum conditions are obtained. The optimal cooking condition is the cooking tempera-ture of 130C under the mixed rate 1 :2 between water and fresh sweet potatoes; the optimal liquefying con-dition is the temperature of 70C for 2hr adding 2% liquefying enzyme; the optimal saccharification conditionis the temperature of 60C for 4hr adding 2% saccharifying enzyme; the fermentation condition is the temperature of 32C for 20hr and the temperature of 34 C for 52 hr under the additives KH, PO 0. 5%, MgSO,0. 2%, NaCI 0. 1%, CaC1, 0.2%, active matter A 2%, active matter B 1% with 4% yeastKeywords sweet potato; fuel alcohol; high concentration fermentation; yeast石油是当今世界的主要能源,是一种不可再生的海等城市已全部改用无铅汽油化石燃料.一旦地球的石油储存量被开采及消耗完燃料乙醇是一种可再生的生物能源,在我国主要了,而现代工业技术一时又不能生产替代石油新产品用粮食作物玉米、小麦生产,原料紧缺,因此拓展生物时,其后果是不堪设想的.寻找可再生性的替代能源,质原料,利用非粮食的淀粉生物质或非淀粉的纤维素特别是新的液态燃料,已成为维持人类社会可持续发生物质作为原料,生产燃料乙醇,意义重大高淀粉红展的紧迫任务特别是中国,开发可再生的替代燃料,薯是一种工业用的能源作物,其淀粉含量在30%左减少对进口的依赖,以保障石油安全,维持可持续发右,用于制备燃料乙醇是南方地区的好选择.但其工展,已成为当务之急(2艺主要采用玉米乙醇工艺,存在废水排放大,分离能乙醇是来自可再生资源的最有发展前景的液态耗高等问题燃料.在汽油中添加10%~15%酒精组成的复合燃实验是在鲜红薯制备燃料乙醇的专利技术(专料,称为汽油醇,为“无铅汽油”之一种,近来,北京、上利:申请号2065101249801公开号CN19666A)基中国煤化工收稿日期:2007-12CNMHG联系人:龚大春(1968—),男,副教授,博士研究生,主要研究方向为生物化工三峡大学学报(自然科学版)2008年8月础上,通过解决红薯燃料乙醇的浓醪发酵系列关键问调加水比.液化:取一定量的淀粉酶在一定时间下对题,构建髙浓度发酵制备红薯燃料乙醇新技术.通过红薯进行糊化和液化.糖化:在一定温度下糖化一定添加活性物质,减小酒精抑制,缓解髙渗透压对酵母时间酵母活化:称取一定的酵母用2%葡萄糖溶液产酒的影响,最终实现红薯的高浓度发酵进行活化.发酵:将发酵醪装入三角瓶,接种发酵,包扎好放入培养箱培养发酵72~96h.蒸出酒精,记录1实验材料与方法蒸出酒精的体积,温度和酒精度,计算出酒率1.4分析检测方法1.1材料和实验设备(1)还原糖:DNS法测定(1)原料.红薯:产地湖北宜昌,DNS法检测得淀(2)pH值:酸度计测定粉含量20%以上,选择成熟好,淀粉含量高、无霉烂、(3)酒度的测定.采用比重法.取出成熟发酵醪无病虫害的鲜红薯100mL,置于250mL蒸馏烧瓶中,并用50mL水冲洗(2)酶制剂耐高温α淀粉酶(不小于4000单位/量桶,加入圆底烧瓶中,常规蒸馏,收集100mL的蒸g):北京奥博星生物技术有限责任公司;糖化酶馏液,用酒精计温度计读取酒度和温度,计算出醪液(500单位/g);湖南省津市市新型发酵有限责任公在20℃下的酒精度(4)红薯中淀粉含量的测定.取试样1.5~2g研3)实验试剂.DNS试剂,硫酸铵,硫酸镁,蛋白碎转入250mL三角瓶加100mL的2%盐酸溶液胨酵母抽提物,磷酸二氢钾,活性物质A,活性物质瓶口上安回流冷凝器或长玻璃管沸水浴3h.取出迅B活性干酵母,维生素B12,维生素C,氯化钙速冷却用20%氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性(4)实验设备. Model Spx250B-z型生化培养箱,滤纸过滤,滤液用500mL容量瓶接收,用水充分洗涤L203电子天平,紫外/可见光分光光度仪,架盘药物残渣,然后用水定容,用DNS测溶液中糖含量,从而天平,DHG9140A型电热恒温干燥箱,气相色谱仪.可转算出红薯原料中淀粉含量1.2实验溶液的配制(5)水分测定0.将红薯洗净切碎,取10g放入(1)2%葡萄糖溶液的配制:准确称取2g无水葡蒸发皿中,于干燥箱中105℃温度下干燥约4h.直到萄糖粉末(预先于100~105℃烘干),用水溶解,加5恒重为止衡重后测干重最后按以下公式计算:水分mL浓HCl,用水定容至100含量=(10-最后干重)/10(2)DNS溶液的配制:取6.3g的3,5-二硝基(6)出酒率的计算.计算公式如下:水杨酸溶于262mL2mol/L的氢氧化钠溶液中.再出酒率=酒精体积X酒精含量×100%将此溶液与500mL含有182g酒石酸钾钠的热水混合向该溶液中再加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠,充15CO2失重分析分搅拌使之溶解,待溶液冷却后,用水稀释到1000取锥形瓶一个加入红薯淀粉30g、糊化,加水到mL储存于棕色试剂瓶中(需要在冰箱中放置一周方100mxL.加人a淀粉酶2%,于70℃水中液化2h,灭可使用)活5min,调pH值4.2.加入糖化酶2%,于70℃水中(3)液体培养基:KH2PO0.5%MgSO10.2%糖化4h.加入液体培养基中调pH4.0~4.5,接种活NaC10.1%、CaCl20.2%、(NH1)2SO10.5%,酵母化过的酵母4%控温发酵并每小时称重一次锥形瓶抽提物5%维生素B2、维生素C各半片,活性物质并记录数据A2‰,蛋白胨3%,三梨醇1%7],1.6高浓度酒精发酵的影响因素及实验研究结果1.3操作方法(1)还原糖浓度变化的研究.红薯淀粉经糊化,加1.3.1工艺流程水定容到100mL.加入a淀粉酶2%,于70℃水中液-淀粉酶化2h,灭活5min,调pH值4.2.加入糖化酶2%于70℃水中糖化4h.加入液体培养基中.调pH4.0红薯→洗净→蒸煮(130℃)→研碎(70℃)→糖化(60℃)→调4.5,接种活化过的酵母4%每3h测一次还原糖浓→发酵→蒸馏→成品酒精→测酒精度糖化酶度并中国煤化工CNMHG粉糊化后再加入1.3.2工艺操作2%的a淀粉酶于70℃水中液化2h,灭活5min,调原料的蒸煮:红薯较和缓的条件下蒸煮,研碎并pH值4.2.加入糖化酶2%,于70℃水中糖化4h加第30卷第4期何华坤等高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究入液体培养基中.调pH4.0~4.5,接种活化过的酵和活性物质A量的添加进行四因素三水平正交实验母4%.每4h取样稀释至一定倍数后用血细胞计数设计.实验因素水平表如表1所示板在显微镜上测其个数表1试验因景、水平(3)活性物质A对酵母产酒能力的影响.取锥水玉米醪酵母抽提物活性物质A酵母量瓶两个各加入红薯淀粉30g糊化加水到100mL再液化,糖化.向溶液中加入液体培养基,1号不加活性3%2%物质A,2号加人2‰活性物质A.调pH4.0~4.5,%啪接种用2%的葡萄糖溶液活化过的酵母4%.控温发5%酵72h.蒸馏并测定酒精度1.10最佳发酵工艺的验证(4)高渗透压对酵母的影响2.取250mL锥形用本实验所分析的最优培养基成分,采用分步液瓶两个,编号1,2.分别加红薯淀粉30g液化糖化.化、同步糖化发酵条件进行发酵.取一个锥形瓶,加入加入液体培养基:KHPO0.5%、MgSO40.2%、NaCl经蒸煮,研碎的红薯200g、糊化,调加水1:1.加入a0.1%、CaC20.2%、(NH1)2SO10.5%,1号不加活性淀粉酶2%于70℃水中分步液化2h,灭活5min,调物质B,2号锥形瓶还加入1%活性物质B.调pH4.5pH值4.2.加入糖化酶2%和液体培养基中.调pH5.5,接种用2%的葡萄糖溶液活化过的酵母4%.4.0~4.5,接种用2%的葡萄糖溶液活化过的酵母发酵72h.蒸馏并测定酒精度4%,控温发酵72h1.7发酵工艺研究及实验结果(1)分步液化对实验的影响取两个锥形瓶,编号2实验结果与讨论1,2各加入红薯淀粉30g、100mL水.各加入a淀粉酶2%,1号一次液化于70℃水中液化3h.2号分32.1红薯中淀粉含量的测定等份每隔1h加入总共液化3h.灭活5min.调pH值红薯经酸解后测得淀粉含量为18.6%,红薯粉4.2.加入糖化酶2%,于60℃水中糖化4h.测定还原淀粉含量为80.4%糖浓度2.2水分测定2)同步糖化发酵工艺.取两个锥形瓶,编号1,2红薯在105℃下干燥至衡重后测干重测得红薯各加入红薯淀粉32g糊化,加水到100mL1号,2号水分含量为74.3%红薯粉中水分含量为15,2%各加入a淀粉酶2%,于70C水中液化2h,灭活52.3co2失重分析min,调pH值4.2.1号加入糖化酶2%,于70℃水中依实验步骤,每隔1h测定一次CO2失重记录实糖化4h.2号加入糖化酶2%,于70℃水中糖化1h验数据,以CO2失重值为纵坐标,反应时间为横坐标向1、2号锥形瓶中加入液体培养基调pH4.5~绘制曲线图,如图1所示5,接种用2%的葡萄糖溶液活化过的酵母4%,0.066酵72h.蒸馏并测定酒精度0.0641.8对单因素试验结果的分析0.062(1)蒸煮温度影响因素的选择与确定.分别在110℃、120℃、130℃温度下对红薯蒸煮30~45min0.058取充分研碎熟红薯200g于1,2,3号锥形瓶中糊化,0.056调加水比经2%的a淀粉酶70℃下液化2h,和2%的糖化酶60℃糖化4h,调pH到4.0~4.5,再以干重的4%的酵母量接种,发酵72h图1CO2失重曲线(2)料液比影响因素的选择与确定取200g熟红由CO2失重曲线知在发酵开始阶段由于酵母进薯3份,调加水比1:1,1:2,1:3,经2%的a淀粉行厌氧发酵不断产生CO2和酒精在22~24h进入酶70℃下液化2h,和2%的糖化酶60℃糖化4主发中国煤化工重也最大以后由于pH到4.0~4.5,再以干重的4%的酵母量接种环境H一死亡发酵能力下降72h产酒CNMH低1.9正交实验设计2.4高浓度酒精发酵的影响因素及实验研究结果用正交实验对不同酵母量,玉米醪酵母抽提物2.4.1还原糖浓度变化的研究70三峡大学学报(自然科学版)2008年8月按照实验步骤,每3h测定一次还原糖浓度,以表3活性物质B对产酒率的影响还原糖浓度变化为纵坐标,反应时间为横坐标绘制曲所加物质无活性物质B活性物质B(1%)线图,如图2所示出酒率%86.9%实验研究表明向培养基中加入活性物质B可降低葡萄糖高浓度影起的高渗透压对酵母的影响,得到较高的出酒率2.5发酵工艺研究及实验结果2.5.1分批液化工艺的研究对分批液化工艺的研究,测糖化结果还原糖浓度所得数据如表4所示表4分批液化对结果的影响图2还原糖浓度变化曲线由实验结果知随着发酵的进行发酵液中的还原编号糖不断被酵母利用产生酒精,实验开始阶段酵母活性丕原糖,v%v21.5%3.7%强产酒较快,发酵后期酵母由于环境的变化酵母活性表3知采用分批液化红薯,液化比较完全彻下降产酒能力降低通过实验数据和还原糖浓度变化底.原料的利用率较高是工业生产的理想方案.实验曲线知,在12~24h之间还原糖浓度急剧下降,是酵对分批液化与一次液化进行了分析发现分批液化还母发酵产生酒精的主要时期原糖浓度明显高于一次液化的结果2.4.2酵母菌细胞密度2.5.2同步糖化发酵工艺按照实验步骤,以活酵母数为纵坐标,反应时间对同步糖化发酵工艺的研究所得数据如表5所为横坐标绘制曲线图,如图3所示示5.5表5同步糖化发酵对产酒的影响编号残还原糖,v0.235%0.15%酒精度,v%13.3%16%把2.5由表5知同步糖化发酵与分步糖化发酵相比同步糖化发酵生产模式省了糖化工段,具有工艺简单发酵时间短;发酵速度快;醪液酒精浓度高.图3计数观察酵母生长曲线2.6对单因素试验结果的分析由活细胞数知酵母的主要生长阶段在21~23h,2.6.1蒸煮温度影响因素的选择与确定此时酵母生长最快,活细胞数量最多,产酒能力最强将反应控制在不同的料液比条件下进行反应,结是发酵的主发酵阶段果见表6.2.4.3活性物质A对酵母产酒能力的影响表6蒸煮温度对最终发酵结果的影响表面活性剂活性物质A对酵母产酒能力的影响编号的研究所得结果,见表2.蒸煮温度/C130表2活性物质A对产酒率的影响酒精度,v%v(20℃)12.7%13.1%13.6%所加物质无活性物质A活性物质A(2%)出酒率/%64.769.3出酒率79.7%由表6蒸煮温度为130C时淀粉转化为溶解状通过表2知活性物质A的添加大大降低了酒精态底,使得淀粉在液化、糖化时水解成对酵母的抑制作用提高了酵母的耐酒能力增加了淀可发中国煤化工率较高粉的出酒率2.6.CNMHO确定2.4.4渗透压的影响将反应控制在不同的料液比条件下进行反应结对副营养物影响的研究其结果如表3所示果见表7.第30卷第4期何华坤等高浓度发酵制备红薯燃料乙醇的研究71表7加水比对最终发酵结果的影响关键问题构建高浓度发酵制备红薯燃料乙醇新技编号术.采用双酶法液化、糖化和控温发酵技术,获得高浓物料:水度发酵工艺,解决葡萄糖高浓度对酵母生长的影响;酒精度,v%v(20℃)14.1%12.6%通过添加活性物质,减小渗透压,缓解渗透压对酵母出酒率%71.9%74.3%76.2%产酒的影响,提高了酵母的抗酒精抑制作用.最终实表7数据显示:最佳料水比是1:1.料水比太小现了红薯的高浓度发酵将发酵酒度提高到15.1%酒度虽高但淀粉出酒率底,料水比增加出酒率增加但(2)实验研究发现在红薯发酵过程中加入酵母生酒精度下降.所以在实验过程中应严格控制加水比.长所需的碳源氮源、无机盐、生长因子,抗抑制剂等,2.7正交实验设计其能补充酵母生长所需的营养元素,提高酵母抗酒精在液化和糖化及各营养成分优化的实验结果的和渗透压的能力增加红薯高浓度发酵产酒率基础上,用正交实验对不同酵母量,玉米醪,酵母抽提(3)本实验主要在以下3个方面取得突破:①同物和活性物质A的添加进行四因素三水平正交实验步液化糖化技术;同步糖化发酵技术;②超级耐高温设计.结果见表8酒酵母在红薯醪液中的生长控制技术;③高密度发酵表8正交试验因素水平表L(3),发酵72h工艺条件的确定酒精度v%v残还原出酒率ABC序号参考文献:12.0%1.20%62.01234522213.1%0.60%66.8[1]谢林张禾美国考察漫谈[J.酿酒科技,200(1):33313.4%0.47%68.3313.3%0.41%67.8[2]姜勇,李春玲,孙承国,等.对玉米生产酒精过程中酵212.5%0.93%63.7母影响因素的研究[门.酿酒科技,2006(3):91-9313.0%0.82%66.3[3]章克昌发展燃料酒精的建议[门中国工程科73212.7%1.20%64.76):89-938322313.2%0.66%67.3[4]沈力匀.工业发酵分析[M].北京:中国轻工业出版社,1112.6%0.71%64.21980:15-17K112.83%12.67%12.73%12.37%[5]杨斌,吕燕萍,高孔荣,等.蔗渣水解液发酵乙醇的研K212.93%12.93%13%12.93%究[J].生物工程学报,1997,13(4):380-386K312.83%13%12.87%13.3[6] Zitomer D H, Shrout J D. High-sulfate, High-ChemicalR0.1%0.33%0.27%0.93%Oxygen Demand Wastewater Treatment Using AeratedMethanogeni Fluidized Beds[J]. Water Environment Re-由表8极差结果分析表明:这4个因素的最佳组search,2000,72(90):90-97合是A2B3C2D3,即:玉米醪4%,酵母抽提物5%,活7]侯保强高浓度酒精发醇酿酒科技,205(4):9396性物质A为2‰,酵母量4%.它们对发酵的影响程[8]戎志南.生物化工新产品与新技术开发指南[M].北京度为:酵母量>酵母抽提物>活性物质A酵母抽提化学工业出版社,2002:4.物>玉米醪[9]李连仲以科学发展观为指导促进社会主义和谐社会发2.8最佳发酵工艺的验证展[].发现,2005(4):49.按照1.10实验步骤对最佳发酵工艺的验证,所10高海军陈坚高细胞密度发酵技术[M]北京:化学得的实验结果如表9所示工业出版社,2006:10.表9最佳发酵工艺的验证[1]陈思磯.酵母生物化学[M].济南:山东科技出版社,2000:92-96.残糖,v%v0.42%[12]刘传斌,白凤武,邵梅,等,自絮凝颗粒酵母酒精高浓酒精度,v%v(20℃℃)15.1%度连续发酵的研究[J].微生物学报,2001,14(3):367出酒率%76.5%中国煤化工编辑周文凯]3结论CNMHG(1)实验通过解决红薯燃料乙醇的浓醪发酵系列