生物质谱的研究及其应用

2004年1月重庆大学学报第27卷第1期Journal of Chongqing UniversityVol 27 No. 1文章编号:1000-582X(2004)01-0123-05生物质谱的研究及其应用吴世容2,李志良,李根容,杨胜喜(1.重庆大学化学化工学院,重庆400044;2.重庆大学生物工程学院,重庆400044)摘要:发展生物质谱是为解决生命科学中有关生物物质分析问题,主要借助软电离质谱技术对生物大分子如蛋白质、核酸和多糖等进行结构分析。生物质谱已成为质谱学中最活跃的研究领域,推动了质谱分析理论和技术的发展。笔者简要介绍了生物质谱的发展,重点讨论因“发明了对生物大分子的质谱分析法”而荣获2002年诺贝尔化学奖金一半的美国科学家约翰.芬恩教授( John B.Fen)和日本科学家田中耕一工程师( Koichi tanaka)分别研发的电喷雾电离质谱(ESⅠ-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱( MALDI-MS)特别阐述它们应用于蛋白质、核酸和糖结构分析及基因组学、蛋白质组学、糖组学等生物组学和化学组学中关键词:生物质谱;蛋白质;核酸;多糖;基因组学;蛋白质组学;糖组学中图分类号:O657.6;O642.2;R917.1文献标识码:A2002年度诺贝尔化学奖授予了三位在生物大分质谱分析问题。近年来涌现出较成功地用于生物大分子研究领域作岀突岀贡献的科学家以表彰他们开创了子质谱分析的软电离技术主要有下列几种:1)电喷雾应用仪器分析法对于生物大分子进行确认和结构分析电离质谱;2)基质辅助激光解吸电离质谱;3)快原子轰的方法。其中约翰.芬恩( John F.Fenn)和田中耕击质谱;4)离子喷雾电离质谱;5)大气压电离质谱。在( Koichi tanaka)各得奖金的1/4(共分享1/2),主这些软电离技术中,以前面三种近年来研究得最多,应要贡献是“发明了对生物大分子进行确认和结构分析用得也最广泛。笔者主要讨论在生物大分子分析方面的方法”及“发明了对生物大分子的质谱分析法”。随的研究与应用着生命科学及生物技术的迅速发展,为了解决生命科学过程中的有关生物活性物质的分析问题而发展并推1电喷雾电离质谱动了生物质谱。生物质谱目前已成为有机质谱中最活电喷雾电离(ESⅠ)是一种“软”电离技术,起源于跃、最富生命力的前沿研究领域之它的发展1917年,但它用于质谱乃80年代事(见图1电喷雾电强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的离质谱)。1984年3-美国耶鲁大学化工系教授约提前完成和有力实施。生物质谱主要用于解决两个分翰.芬恩( John B.Fenn)研究组等首次发表了ESI析问题:精确测量生物大分子,如蛋白质、核苷酸和糖MS实验结果,并于4年后报道首次成功运用ESI类等的分子量,并提供分子结构信息;对存在于生命复MS分析蛋白质。ESl-MS既可分析大分子也可分析杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进行定性小分子。对于分子量在1000Da以下的小分子,会产或定量分析。业已发展了各种新软电离技术及联用技生M十H十或M一N]一离子,选择相应的正离子或术,扩展了质谱可测质量范围,特别是色谱一质谱联用负离子形式进行检测,就可得到分子量。而高达技术和质谱串联技术。在此,主要讨论生物大分子的子在 ESI-MS中生成一系列多电荷离中国煤化工CNMHG收稿日期:2003-0基金项目:霍英东基金[98]与国家“春晖计划”教育部启动基金[99、国家新药基金[97]及重庆市应用基础课题[01资助课作者简介:吴世容(1979—),女,四川什邡人,分析化学2002级研究生;研究方向:天然药物分离分析;生物谱学分析;化学生物药学分析、绿色化学及分析技术。124重庆大学学报2004子,通过数据处理系统能够得到样品的分子量,准确度为质子转移和碱金属加合等。基质必须满足一些共优于0.01%。这些离子(m/z)以“表观”质量数岀现在性:在合适溶剂中溶解性能,对激光吸收性能,合适反谱图,与分子量有密切关系。据报道,ESI-MS通过应活性,首先基质必须在蛋白质溶剂中有好溶解性,常多电荷离子已能测岀分子量达13300Da蛋白质3-3用蛋白质溶剂有盐酸水溶液,水一乙氰/乙醇混合物,或200000Da糖蛋白。ESI-MS或与HPIC联0%甲酸。其次必须能很好地吸收激光,以使能量沉用可进行蛋白质序列和构象分析,酶反应中间体分析积在基质中而非分析物上。另外基质反应活性必须考酶抑制剂机理分析、共价或非共价复合体分析等方面虑:能对蛋白质或其他分析物起共价修饰或氧化作用均获得应用。有人预测用用ESI可侧得数MDa分子的基质不能采用。近期有关基质研究仍很活跃,是量的蛋白质-。热点。用 MALDI-MS分析多肽及蛋白质时,当基质选择妥当之后即着手准备样品。 Tanaka等6把待测多肽溶于甘油中,并与很细金属粉未混合,然后把悬浮液滴到探头上,让激光照射,再进入质谱分析。甘油对377nm激光透明,激光与甘油不发生作用,因此引入PrR金属粉未在溶液中形成吸收中心。 Hillenkamp等认为激光解吸时是底物吸收激光,选择合适基质使之与样品混合就可测量大分子物质,并提出“基质辅助激光解吸”名称。直到选用烟酸作为基质才有突破,烟酸图1电喷雾电离质谱和蛋白质混合溶液滴到探头上,干后用激光照射可得蛋白质分子离子信号。 Tanaka法灵敏度为109mol数量级,受关注则相对不多; Hillenkamp法灵敏度达10-1mol量级,信号强且信噪比高因而被广泛采用,高灵敏度优点显著,样量只需1pmol甚至更少3快原子轰击质谱鉴于分析样品一般都偶极矩大的分子,基质表面准分子离子受到Ar快原子流轰击接受能量,解吸脱离液面溅入气相中。FAB-MS谱中主要出现准分子离子峰而少出现分子离子峰,且在基质加入酸或碱2基质辅助激光解吸离子化质谱或盐使相应准分子离子强度增大。当然也不排除在气2基质辅助激光解吸离子化质谱相中溅出样品分子受轰击产生分子离子,但丰度比准分子离子小得多。由于电离未受加热,所以FAB电离激光解吸电离质谱(LD-MS)早被作为分析难技术特别适合于热不稳定高极性化合物,如蛋白质,核挥发有机物手段,曾用于分析合成聚合物和热不稳定酸及糖类等,测出的质量数上限已可达到10Da。因生物小分子。但K可测分子量均低于3kDa,对生物结构简单而信号持续和重现性好等特点,便于推广,故大分子测定受到很大限制。直到1988年 Tanaka和仍是常用重要的质谱手段Hillenkamp两个研究组分别提出基质辅助激光解4多肽和蛋白质质谱分析吸电离质谱( MALDI-MS,见图2基质辅助激光解吸离子化质谱)后才使LDI-MS应用于生物大分子分蛋白质是生物体中含量最高功能最重要的生物大析得到发展-7。 MALDI-MS分析蛋白质的关键分子中国煤化工占细胞干质量50%以是选择合适的基质首先基质相当于溶剂样品分子被上,在CNMHG由多个氨基酸组成肽基质彼此分开,这种分离削弱了样品分子间相互作用;则称为多肽或为数不大时称为寡肽,组成氨基酸单元然后基质从激光脉冲中吸收能量并转化为固溶体系激称为氨基酸残基。多肽广存于自然界,最重要的是作发能产生瞬间相变,离子形成过程有两临界值:低表面为蛋白质亚单位。蛋自质是一条或多条肽链以特殊方解吸而高本体解吸给岀离子信号。基质能量传递机制式组合的生物大分子,复杂结构主要包括以肽链为基第27卷第1期吴世容等:生物质谱的研究及其应用125础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠后推导整个蛋白质序列而形成三维[称为二级,三级或四级]结构。目前质谱5核酸质谱分析主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。1981年首先采用生物高分子核酸( nucleic acid)存在于一切活细胞FAB双聚焦质谱测定肽分子量,分析十一肽(Mr中,构成单位是核苷酸( nucleoticle)。核酸分为脱氧1318),质谱中岀现准分子离子[M+1]=1319强峰。核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。DNA是谱中出现均为单电荷离子主要包括肽离子,甘油离子遗传信息的载体,RNA在蛋白质生物合成起重要作和甘油簇离子。FAB质谱常用氩Ar作轰击剂,但在用。近来发现质谱是核酸一级结构分析最有利手段某些情况用氙ⅹe效果更好一点。FAB质谱法既可测如核酸的核苷酸顺序可表为5' PAPCPGPTPT3',若正离子谱也可测负离子谱,由于蛋白质和多肽分子含仅关心碱基顺序,则可写成5 ACGTI3′。需注意所表多个易质子化部位所以一般测正离子谱,基质加入酸示核苷酸顺序是从左至右5→3′。多核苷酸片段一端可增强(M+1)+离子强度。分析疏水性肽常用极性为3一端另一端为5′一端;未端可以是不带有磷酸基较小基质,测定负离子谱时则采用碱性液体作基质。核苷3'或5′一羟基也可是核苷酸3′或5′一羟基带有分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分磷酸基团。各核苷酸分子及残基沿序排列就是核酸析,更大分子量的多肽和蛋自质可用MALD质谱或级结构,种类不多但因核苷酸数目和排序不同而构成ES质谱分析。用MALD〕-TOF质谱分析蛋自质最多种不同核酸。用质谱测核酸一级结构,相当测定分早一例是 HillenKamp等于1988年提出用紫外激光子量和碱基序。以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa质谱曾用来测核酸分子量但较困难,其信噪比和蛋白质,精确度开始只有0.5%,后改进到0.1-0.分辨率一般较低。20世纪90年代初 MALDI-TOF2%。MALD-TOF质谱所测质量上限高、灵敏、迅质谱分析核酸只含4~6个碱基、分子量为数kDa低速(