比伐卢定的聚乙二醇化修饰

2013年第21卷合成化学第1期,099-102Chinese Journal of Synthetic ChemistryNo.1,099~102制药技术比伐卢定的聚乙二醇化修饰何燕,邓言波,王良友(1.苏州大学医学部放射医学与防护学院江苏苏州2151232.苏州中科天马肽工程中心有限公司江苏苏州215101)摘要:将比伐卢定(BVLD)多肽链7甘氨酸(Cly)用半胱氨酸(Cys)取代,以聚乙二醇(PEG)定点修饰巯基,采用多肽固相合成法制得[Cy]BLD(2);2与 mPEG-MAL(3a~3c)偶联合成了三个聚乙二醇化修饰的比伐卢定衍生物—[Cys( mPEG200MAL)]BvLD(1a),[Cys(mPG500MAL)]-BvLD(1b)和[Cys(mPEG000MAL)]BvLD(1c),其结构经MS确证。PT和T评价结果表明,1a-1c均表现出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性优于比伐卢定:比伐卢定;聚乙二醇化修饰;多肽合成;抗凝活性中图分类号:062972;R914.5文献标识码:A文章编号:1005-1511(2013)01009904PEGylation of BivalirudinHE Yan. DENG Yan-Do WANG IInstitute of Radiological Medicine and Protection, Soochow University, Suzhou 215123, China2, Suzhou China Tech Peptide Co. Ltd., Suzhou 215101,ChinaAbstract: Three PEGylation bivalirudin( BVLD )derivatives, Cys( mPEG2000-MAL)]-BVLD(1a), [Cys( mPEG5000-MAL)]-BVLD(Ib)and Cys(mPEG10000-MAL)J-BVLD(1c),weresynthesized by addition reaction of mPEG-MAL(3a-3c)and cys] -BVLD(2)which was preparedby replacing the 7-glycine( Gly )of BVLD by cysteine( Cys)with the solid phase peptide synthesisThe structures were confirmed by Ms. The results of Pt and tt evaluation showed that la-Ic exhibited good anticoagulation activities, especially 1b was better than bivalirudinKeywords: bivalirudin; PEGylation; peptide synthesis; anticoagulation activity比伐卢定(BVLD)是由20个氨基酸(DPhe-250mg,价格昂贵。其在肾功能正常的患者体内Po- Arg- Pro-Gly-Gly-Gly-Gly- Asn-Gly- Asp-Phe-Glu-的清除半衰期为25min,虽然比伐卢定于2000年Cu- Ile-Pro-Glu-Glu- Tyr-Leu)组成的水蛭素的衍被批准用于经皮冠状动脉腔内血管成形术的抗凝生物是凝血酶的直接可逆的二价抑制剂,可治疗在2005年被批准用于接受经皮冠状动脉介以与凝血酶的催化位点和阴离子结合位点(底物入治疗的抗凝治疗,但是昂贵的价格限制了其识别位点)结合。BVLD于200年12月15日在临床上的应用。因此,开发长效、安全、经济的被美国FDA批准上市。类似药物十分必要。蛋白质经聚乙二醇化修饰BvLD是一种合成的多肽药物,单次剂量为( PEGylation)后能显著改善其特性,如增加蛋白收稿日期:20120705;修订日期:201211基金项目:江苏省“大学生实践创新训练计划”资助项目(5731504610)中国煤化工作者简介:何燕(1990-),女,汉族新疆昌吉呼图壁人,在读本科生,主要从*YHCNMHG通信联系人:王良友,副研究员,E-mal:jiangyang@gai.com100一合成化学vol.21,2013质对酶的稳定性延长蛋白质在血浆中的半衰期、CH2Cl2(5mL)溶液,Et3N6mmol和对甲苯磺酰降低抗原性和免疫原性等4,已有多个PEG修饰氯6mml,搅拌下于室温反应20h(TC监测)。的蛋白药物上市。于40℃减压旋蒸除去溶剂,加预冷无水乙醚沉本文将BVLD多肽链7甘氨酸(Cy)用半胱降,过滤,滤饼用二氯甲烷溶解,依次用0.1%柠氨酸(Cys)取代,以PEC定点修饰巯基,采用多肽檬酸钠溶液(3×10mL),饱和NaCl溶液(3×足固相合成法制得[Cys]BvLD(2);2与mPEG-量)洗涤无水Na2SO4干燥12h,于40℃减压旋MAL(3a~3c)偶联合成了三个PEG修饰的BV-蒸除去溶剂,乙醚沉降抽滤滤饼干燥得白色粉LD衍生物——[cys(mPEG2000MAL)]BVLD末 mPEG-OTs(Ia-le)(1a),[ Cys(mPEG5000-MAL )]'-BVLD(1b)F在反应瓶中依次加入Ia~lc1mmol的DMFCys(mPG00OMAL)]BVLD(1c),其结构经(10mL)溶液邻苯二甲酰亚胺盐(P6mmolMs确证。PT和TT评价结果表明,1a~1c均表N2保护下于120℃反应4h。于90℃减压旋蒸现出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性优于除去溶剂,依次加入无水乙醇与水合肼,回流反BvLD。应2h。于60℃减压旋蒸除去溶剂,残余物用氯甲烷溶解,过滤滤液依次用水(3×10mL),饱1实验部分和NaCl溶液(3×足量)洗涤,无水Na2SO4干燥1.1仪器与试剂12h,于40℃减压旋蒸除去溶剂,乙醚沉降,抽创新通恒半制备高效液相色谱仪[ Phenome滤滤饼干燥得白色粉末 mPEG-NH2(Ⅱa~IenexC】8柱,250mm×30mm(100A,10μ),流动在反应瓶中加人Ⅱa~Ⅱe1mmol的二氧六相A:0.05%TFA水溶液,B:0.05%TFA(三氟乙环(40m)溶液,搅拌下于80℃加马来酸酐4酸)70%CH2CN/H2O,流速20mL·min-1,检测mmo,反应30min。于55℃减压旋蒸除去溶剂波长215m],戴安U00高效液相色谱仪乙醚沉降,抽滤,滤饼用醋酸酐溶解,加人无水醋[HPLC, Prosphere C18 #, 250 mm x4. 6 mm(100酸钠,搅拌下于100℃反应45min(反应液由淡黄A,5μ),流动相同前,流速1mL·min];Bmk.色逐渐变为褐色液体)。加水(10倍体积),分液,er MtQ型质谱仪水层用CH2Cl2(3×10mL)萃取,合成并有机层,固相合成载体cTC树脂(原始替代度为13用饱和NaCl溶液(3×足量)洗涤,无水Na2SOmnlg2),Dc(M,N一二环己基碳二亚胺),千燥12b,40℃减压旋秦除去溶剂,乙醚沉降,HoB(L羟基苯并三氮唑)以及10种Fm0c保护抽滤,滤饼干燥得淡黄固体3-3氨基酸,上海吉尔生化公司;TFA, Acros;EDT(乙Ia~3c的产量及产率见表1。二硫醇)和TMBS(三甲基溴硅烷), Fluka;聚乙二2)[Cys]BVLD(2)的制备醇的平均分子量为mPEG200OH,mPEC000-CTC树脂15.00g,HOBt和HBTu为缩合剂,OH和mPEG00o,sgma;其余所用试剂为按照反应的投料比称取相应量的Fmc.luOH,分析纯。Fmoc-Tyr( Bu)-OH, Fmoc-Glu( OtBu)-OH, FmocPro-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp1.2合成(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn( Trt)-OH(1) mPEG-MAL(3a~3c)的合成通法Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-D-Phe-OH FA Fmoc-Arg在反应瓶中依次加入 mPEG-OH1mmo的(Pbf)-OH,根据[Cys]BVD的氨基酸顺序,按表1Ia-3c的产量及产率Table1 Output and yield of Ia-3emPEG2000(2 g)mPEG5000(5 g)mPEC1000010g)ⅡⅡb3c产量/g4.401.423.15产率/%72488.028.442.379.5ovL中国煤化工0.36CNMHG 58.4第1期何燕等:比伐卢定的聚乙二醇化修饰Fmoc-AA. HOBt, HBTU/HATU1誘%。「x临袭费季)rDIPEA. DMF. CTC洗涤3x1min2-CTC6%茚三酮的乙醇溶液,80%苯酚的乙醇溶液2%KCN的吡啶溶液(1mmol·L-,树脂有颜色为阴性)mIn图1Fmc固相多肽合成2CTC的流程图Figure 1 The flow chart of the Fmoc solid phase peptide synthesis of 2-CTov(六氢吡啶):VDMF)=1:3标准的Fmoc固相多肽合成方法(图1)合成D1.95(2),Cu4.06(4),Pm2.92(3),Arg0.96Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Cys'( Trt)-Cly-Asn (1), Gly 4. 21(4), Tyr 1.06(1),Phe 1.92(2)(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu )-Clu( Ot- Ile 1. 01(1), Leu 0.97(1)Bu)-Ile-Pro-Glu( OtBu )-Glu( OtBu )-Tyr( tBuLeu-CTC(2CTC)。按照8叫L·g1树脂用量配1.31的抗凝活性评价制并加入裂解液以混合溶剂[v(TFA):V(苯甲(1)1的凝血酶原时间(PT)测定硫醚):v(EDT):V(苯甲醚)=90:5:3:2]为裂将PT试剂和受检血浆置37℃水浴中预温5解液,于0℃反应90mn。过滤滤液旋转蒸发除min。取试管1支加入受检血浆01m,一定量去TFA,加冷冻无水乙醚(6倍体积)沉淀出白色的比伐卢定或1(用p74的 Tris-HCI缓冲液配固体3000mm离心5mn,滤集固体用水溶解,制成所需终浓度),置37℃水浴中预温30s,再加冰冻干燥至恒重得白色于粉2粗品62mg。人预温的P试剂0.2mL,混匀,立即启动秒表计2粗品经HPC纯化得2纯度大于95%时。不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止(HPC),其结构经MS和氨基酸组成分析确证。时,记录所需时间。重复三次取平均值空白对由MS分析可知,在11122处有主峰,与理论分照为 Tris-HCl缓冲液测试结果见表2子量2223.99分子带两个电荷一致。2经酸性水表21的P评价数据解(6mo·L1盐酸水溶液,于110℃反应22hTable 2 Pt evaluation data of 1下同)的氨基酸组成实测值与理论值(括号内)相等质量浓度等摩尔浓度符:Asp1.99(2),clu4.11(4),P3.9(3),Arg0.96(1),Gy4.21(4),Tyr1.07(1),Phe终浓度凝固时间/s终浓度凝固时间/s1.92(2),Ie0.99(1),Leu0.98(1)。空白对照11.92(0.40)11.92(0.40)(3)1a~1c的合成通法比伐卢定2.041.9(1.49)2.041.9(1.49)在反应瓶中加入2的水(10mL)溶液,用5%2.026.5(0.85)2.026.5(0.85)碳酸氢钠溶液调至pH7~8,加入3a~3c,于室温2.015.0(0.15)4.040.3(2.08)反应至终点(HPLC监测)。HPLC分离提纯得1b2.016.2(0.64)7.0514(0.71)la~1c,纯度大于95%, MALDI-TOF-MS分析结2015.8(0.9)12.044.0(0.80)果表明,在4232附近有一系列峰,相邻两峰分子量相差约44,具有聚乙二醇的典型结构特征。经终浓度/g·mL-1,凝固时间栏括号内为标准差酸性水解的氨基酸组成实测值与理论值(括号由表2可见1a~1c不仅在等质量浓度测定条件内)相符。1a:ABp1.99(2),Cu4.11(4),Po下仍保留了一定的抗凝活性;而且在等摩尔浓度309(3),Ag0.96(1),Cy4.21(4),Tyr1.07下也保持了良好的抗凝活性其中1b的抗凝活性(1),Phe1.92(2),le0.99(1),Leu0.98(1优于比伐卢定1b:Asp200(2),chu4.31(4),Po3.18(3),(2)1的凝血酶时间(TT)测定Arg1.03(1),oy4.13(4),Tyr1.02(1),Phe取受检血中国煤化工一定量的1.82(2),Ⅱel.06(1),Leu1.03(1)。1e:Ap比伐卢定或1CNMHG冲液配制102合成化学vol.21,2013成所需终浓度),置37℃水浴中,预温5min,再加果见表4。由表4可见,1a~1c仍保持了良好的人0.1mL标准化“凝血酶”试剂,同时启动秒表抗凝活性,其中,1b的抗凝活性最佳。记录血浆凝固时间。重复三次取平均值测试结果见表3。从表3可以看出,1a~1c均具有较好结果与讨论的抗凝活性(正常对照平均值18.0s)。比伐卢定的构效关系研究表明,其氨基端带表31的T评价数据正电荷区域(DPhe-Pro- Arg-Pro)和羧基端带负电Table 3 tt evaluation data of 1荷区域( Asn-Gly- Asp-Phe-Glu-Gu-le-Pro- Glu-Glu-Comp终浓度/吗·mL凝固时间/s标准差/sTyr-Leu)是其与凝血酶结合的两个关键区域,而0.055-位至8-位的4个Gy只起连接作用,因此选择比伐卢定7位或8-位的甘氨酸进行聚乙二醇修饰是理想的0.200.81位点。初步活性评价表明,本研究合成的三种不32.8同平均分子量的1a~lc能保持较好的体内抗凝1b0.0532.51.33活性,在相同摩尔浓度下,1b的抗凝活性优于比0.1026.6伐卢定,有望进一步开发成具有比比伐卢定更长半衰期的抗凝药物。表41的APT评价数据(等质量浓度)Table 4 APtt evaluation data of 1参考文献标准差/8[1] Reed M D, Bell D. Clinical pharmacology of bivaliru空白对照1.31[J]. Pharmacotherapy, 2002比伐卢定51.71.9[2] Maraganore J M, Bourdon P, Jablonski J, et al. De-sign and characterization of hirulog: A novel class of49.90.8272.71.11ry,1990,29(30):7095Ic59.2routine care of patients undergoing percutaneous coro终浓度004ug·mLnary intervention[J ] European Heart Joumal, 2010(3)1的活化部分凝血酶时间(APrT测定取APTT反应液0.1mL和受检血浆01mL[4]王良友,刘克良.多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰于塑料离心管中,并加入5μL的比伐卢定或1方法[J].有机化学,2003,23(11):1320-1323[5] Ryan SM, Mantovani G, Wang X, et al. Advances(用pH74的 Tris-HC1缓冲液配制成终浓度0.04PEGylation of important biotech molecules: Deliveryμg·mL的溶液),置37℃水浴中预温3minaspects[ J]. Expert Opinion Drug Delivery, 2008,5再加入预温的APTT催化剂0.1mL,混匀,立即启(4):3712383动秒表计时。不断地倾斜试管至有絮状沉淀生成时,记录所需时间。重复三次,取平均值,测试结(上接第76页)[10] Raposo MMM, Garcfa-Acosta B, Abalos T, et al(I)ion selective electrodes with PVC membranesSynthesis and study of the use of heterocyclic thiosem-based on two bis- thioureas as ionophores: 1, 3-Bisicarbazones as signaling scaffolding for the recogniti(N-benzoylthioureido benzene and 1, 3-bis(N-fuof anions[ J]. J Org Chem, 2010, 75: 2922-29331.【- of hazardous[11] Wilson D, Aradab M A, Alegrete S, et al. Lead中国煤化工CNMHG