聚乙二醇修饰β-干扰素的研究

微生物学免疫学进展2004年第32卷第3期聚乙二醇修饰β千扰素的研究徐静,倪道明,张振龙(北京生物制品研究所,北京100024)摘要采用平均分子量为5kD的已活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEC)对重组人β干扰素(hFNB)进行化学修饰。优化修饰条件,选择对hFNβ反应性高的修饰剂制备三种不同修饰程度的修饰物,并对修饰物进行初步检定。三种修饰物的修饰率分别为10.12%、22.99%、42.47%;比活性分别保留为原来的93.53%、48.69%、13.18%;PEG修饰后的thINβ在pH7时的溶解度增加关键词:重组人β-干扰素;聚乙二醇;化学修饰中图分类号:R392.11文献标识码:A文章编号:10055673(2004)03003004Preliminary study on chemical modification of interferon-p by polyethylene glycol XU Jing, NI Dao-ming, ZHANGZhen-Long( National Vaccine and Serum Institute, Beiing 100024, ChinaAbstract: rhIFN-B was modified by activated methoxypolyethylene glycol mPEG). with the optimization of modifying con-ditions, CC-mPEG was chosed to modify rhIFN-B and three peglated rhIFN-B were prepared, the extents of modification are10. 12%, 22.99%, and 42. 47% respectively. Specific activity of three peglated rhIFN-B is 93. 53%,48.69%, 13.18%of original rhIFN-B respectively. Polypeglation had effect on the configuration of rhIFN-B. The peglation increased the solubility of rhIFN-B at neutral pHKey words: rhIFN-B: Polyethylene glycol; Chemical modificationhFNB是一种多功能细胞因子,它可以在细胞大肠杆菌表达的 rhIFN-Bserl7为北京生物制品表面与特殊的受体结合而发挥抗病毒、抗细胞增殖和研究所中试一室提供(纯度为95%以上),氰尿酰氯免疫调节作用。1993年,hFNB获美国FDA批准用活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、琥珀酸琥珀酰于多发性硬化症(MS)的治疗。另外hFNB也可亚胺酯活化的mPEG、对硝基苯碳酸酯活化的以用于上皮癌、肾癌、基底细胞癌、乙型肝炎、丙型肝mPEG、2,4,6-三硝基苯磺酸均购自 SIGMA公司,水炎等疾病的治疗。与其它基因工程类药物一样,由于合茚三酮购自北京化学试剂公司,水疱性口腔炎病缺乏天然蛋白质所具有的糖基,hFNB的半衰期短毒(VSV)、人羊膜细胞均为北京生物制品研究所中并具有一定的免疫原性、疏水性较强等特点因此存试一室保存, rhIFN-B ser7国际标准品购自英国在着进一步改善hNB的临床治疗效果的需求。NBSC1977年 Abuchowski等证明:作为治疗药物聚乙二醇2透析 rhIFN-B(PEG, polyethylene glycol)修饰的蛋白质比未修饰的透析液为含有0.1%SDs的0.1mo/L的四硼蛋白质更有效。目前,国内外已经尝试用PG对酸钠溶液pH值为92。透析后取样,Lowy法测多种蛋白质类药物进行修饰并取得了一定的进展,定 rhIFN-B蛋白浓度。如腺苷脱氨酶、天冬酰胺酶、粒细胞集落刺激因子、以3修饰条件的优化及修饰剂的选择及两种亚型a-千扰素的PEG修饰物已获美国FDA3.1反应时间对修饰反应的影响批准上市。作者用PEG对研制的 rhIFN-B serl7进行取透析后的 rhIFN-B(1.18lmg/ml)3ml,按了化学修饰优化修饰条件,并对修饰物的一般生物50:1的比例加入氰尿酰氯活化的mPEG(CC学特性进行检定mPEG),25℃振荡反应。分别于0.5、12、3、4h取出材料与方法0.5ml,用三硝基苯磺酸(TNBS)法(测修饰率。琥珀酸琥珀酰亚胺酯活化的mPEG(SS-mPEG)、对硝1材料基苯碳酸酯活化的mPEG( NPC-mPEG)以相同的方中国煤化工收稿日期:2003-12-15;修回日期:20040202作者简介:徐静(1974),女,硕士,主要从事基因工程产品CNMHG的研究开发工作微生物学免疫学进展2004年第32卷第3期法进行测定,用三硝基苯磺酸法(TNBS)测定S将pH值调到8.0,以 Sephadex G25为层析介质,上mPEG的修饰率,茚三酮法测定 NPC-mPEG的修样后,用pH8.0的20mmo/L的磷酸盐缓冲液洗脱。饰率52PEG2、PEG3的纯化3.2反应温度对修饰反应的影响将修饰后样品pH值调到5.5,以 Sephacryl S-取透析后的thIN-B(1.18lmg/ml)3ml,按100为层析介质,上样后,用含0.1% SDS pH5.5的20:1的比例加入C-mPEG混匀,分装于3支试管50mmo/L的醋酸缓冲液洗脱。将 Sephacryl S100中,每管lml,于4℃反应2h4℃反应Ih再25℃反凝胶过滤后样品浓缩,调pH值到8.0,以 Sephade应1h25℃反应2h,测定修饰率。 SS-mPEG和NPCC25为层析介质,上样后,用pH8.0的20mmo/LPEG以相同的方法进行测定的磷酸盐缓冲液洗脱33溶液pH值对修饰反应的影响6修饰物的一般生物学特性检定取透析后 rhIFN-p(1.18lmg/ml)5ml,分别取用TNBS法测定三种修饰物的修饰率。做非还lml置于5支试管中,调节pH值分别为7.0、7.4、原 SDS-PAGE,用 TotalLab1 D Gel analysis vI,0软件8.0、8.49.2。每支试管分别加入 CC-mPEG6mg,对PEG1胶带进行扫描,分析纯度。在 WISH-VSV4℃振荡反应2h,用5 mol/L NaOH将各样品pH调系统上按细胞病变抑制法测定hFNβ及其三种修至92,测修饰率。 SS-mPEG和 NPC-mPEG以相同饰物的生物学效价,用Lowy法测定蛋白含量3),计的方法进行测定。算每种样品的比活性,比较hFNB及其三种修饰34 rhIFN-B浓度对修饰反应的影响物的比活性取0.6ml透析后的hFN-B(8.36mg/ml),按7rhINβ及其三种修饰物溶解度的比较10:1的比例加入CC-mPEG,混匀,立刻倍比稀释4分别取0.2mg/ml的thFN-β及其三种修饰物次,使溶液中 rhIFN-B浓度分别为8.36mg/ml4.182.5ml,通过 Sephadex G25凝胶过滤将缓冲液置换mg/ml2.09mg/ml、1.045mg/ml0.523mg/ml,4℃为不含 SDS, PH9.0、20mmo/L的磷酸氢二钠溶液。振荡反应2h,测定修饰率。SS-mPEG和 NPC-mPEG取样进行220~100nm紫外可见光谱扫描,将pH以相同的方法进行测定。调至7.0,室温放置过夜,再进行同样的扫描。同时3.5反应物摩尔比对修饰反应的影响肉眼观察各溶液在不同pH值时的浑浊度。取透析后的 rhIFN-B(1.18lmg/ml)4m,分别取lm1置于4支试管中分别按5:1、10:1、20:1、结果50:1的比例加人 CC-mPEG,4℃振荡反应2h,测定1修饰条件对修饰反应的影响修饰率。SS-mPEG和NPC-mPEG以相同的方法进1.1反应时间对修饰反应的影响行测定。三组反应在0.5h时即有一定的修饰率随着时4修饰物的制备间的增加,修饰率也随之增加。虽然2h以后修饰率取透析后 rhIFN-B(5.166mg/ml)l5ml,均分于3仍有增加,但增加幅度不明显(图1)。 SDS-PAGE支试管中,分别按5:1、10:12.5:1的比例加入显示,随着反应时间的增加修饰物的不均一性增加CC- mPEG,25℃振荡反应2h,加人30%的冰醋酸终(图略)。综合考虑,为此选择2h作为修饰反应的止反应。制备修饰程度分别为低、中、高的三种修饰时间。 CC-mPEG的修饰率明显高于其他两种PEG物,分别命名为PEG1、PEG2、PEG3。的修饰率,在此条件下 CC-mPEG更适合用来修饰5修饰物的分离纯化ThIFN-B5.1PECI的纯化1.2反应温度对修饰反应的影响以 Sephacryl S200为层析介质,将修饰后样品实验结果表明,在很温和的实验条件下(4℃或上样,用50mmoL的醋酸缓冲液洗脱。 SDS-PAGE25℃)修饰反应即可发生,随着温度的升高,修饰率分析各组分选择性地收集以结合单个PEG分子的会有所上升,但增加幅度不明显(图1)。为了尽可rhIFN-B为主的组分。将样品浓缩后,再以 Sephacr-能地ylS-100为层析介质进行凝胶过滤, SDS-PAGE分析作为中国煤化子影响,故选择4℃PEG的修饰率明各组分,收集以结合单一分子PEG的 rhIFN-B为主显高CNMHG说明在此条件下的组分。将 Sephacryl S-100凝胶过滤后样品浓缩, CC-mPEG更适合用来修饰hFNB。微生物学免疫学进展2004年第32卷第3期1.3溶液pH值对修饰反应的影响随着 rhIFN-B蛋白浓度的增加,各组修饰反应pH值越高,反应的修饰率越大(图1)。但pH值的修饰率有所增加(图1)。可能由于浓度的增加加过高,会影响蛋白质的稳定性,考虑到hFNB在大了hFNB分子与PEG分子之间接触碰撞的机H时能够保持稳定,对活性没有明显影响因此选会但浓度加大的同时也增加了 rhIFN-B形成多聚择pH92作为反应体系的pH值。同等条件下体的机会。为了兼顾两方面的因素,选择5mg/mlmPEG的修饰率明显高于其他两种PEG的修饰率的蛋白浓度作为修饰反应中 rhIFN-B的最适浓度。明在此条件下 CC- mPEG更适合用来修饰hIFNβ。同等条件下,C-mPEG的修饰率明显高于其他两种1.4rhFN-β浓度对修饰反应的影响PEG的修饰率。40.20.00%Fa820.00%△320Tiee (h)4℃24℃2sTh25℃2h7.488.49.2aperature30.00%25.00%50.00%20.008300010.00%10.000.5231.0452.094.188.Concentration (ag/al)Molar ratio of pEG to rhIFN-B图1各种修饰条件对修饰反应的影响ig. 1 Effect of react conditions on rate of modification1.5反应物摩尔比对修饰反应的影响随着PEG与 rhIFN-B摩尔比的增加,修饰率9ED显增加(图1)。因此,在修饰物的制备过程中,可以根据对修饰程度的不同需求选择合适的PEG与hFNB摩尔比。同等条件下, CC-mPEG的修饰率仍明显高于其他两种PEG的修饰率2修饰物的纯化PEGI经过 Sephacryl S200、 Sephacryl S-10020.1kDSephadex G25三步分离纯化, SDS-PAGE电泳显示144kD主要为结合1分子的PEG,电泳扫描显示纯度达9501%;PEG2纯化后主要为结合2分子的PEG;纯化后的PEG3平均每分子thN结合4分子的图2rhINβ及其三种修饰物的 SDS-PAGEPEG,见图2。V凵中国煤化工its three3修饰物的一般生物学特性检定测定纯化后三种修饰物的修饰率,PEGl为CN MHGLane b, unmodified10.12%、PEG2为22.99%、PEG3为42.47%。rhIFN-B; Lane c: PEGI; Lane d: PEG2; Lane e: PEG3傲生物学免疫学进展2004年第32卷第3期rhIFN-B及其三种修饰物的比活性比较结果见表l。PEG的修饰对 ThIFN-B的活性有影响影响程度与三种修饰物的比活性均有不同程度的下降,分别为修饰程度相关。修饰前hIFNβ的9536%48.49%、13.30%,说明表1thNB及其三种修饰物比活Table 1 Specific activity of rhIFN-B and three modified rhIFN-BConcentrationActivitySampleSpecific activiySpecific activity(IU)(IU/mg)preserving( %rhIFN-B5.13×10°2.33x1PEGI0.21293.56PE30.220.70×100.31×1013.304溶解度比较子PEG时,活性降低不明显,为修饰前的93.53%。肉眼观察, hIFN-B溶液于pH9.0时澄清透明,说明结合一分子的PEG并不会对hFNB与受体当将pH调到7.0后,溶液浑浊、有颗粒状物析出。的结合有太大的影响。紫外可见光谱扫描结果显三种修饰物在pH9.0和pH7.0时溶液均为澄清透示,单一分子PEG的修饰并未影响芳香族氨基酸在明。扫描结果显示(图略),rhFN-β溶液在pH9.0thFN-β结构中的暴露程度,而多分子的PEG修饰时的扫描结果与规程一致;溶液在pH7.0时的扫描对芳香族氨基酸的暴露程度有影响,因而改变了结果显示,hFNB在278m的特征吸收峰消失,大hFNB的光谱学特性。溶解度研究结果表明,三波长时的吸收明显增强。三种修饰物在pH9.0和种修饰物在中性pH值时的溶解度均要高于thFNpH7.0时的扫描图谱无明显差异。说明PEG对β,与文献报道一致。修饰后hFNB的抗原性体rhIFN-β的修饰增加了其在中性pH时的溶解度内外稳定性的变化药物代谢动力学等性质正在研讨论究中。参考文献:选择应用较广的三种已活化的PEG:CC.(1)cbsL, Godkin DE, Rudick RA,tal. Advances in specificmPEG、Ss-mPEG、NPC-mPEG进行研究,最后选择对therapy for multiple sclerosis[ J]. Curr Opin Neuro 1994, 7(3):hFNB反应性最高的 CC-mPEG对 rhIFNβ进行修250254(2) Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, et al. Effect of covalent饰。PEG修饰对thINβ有正负两方面的影响(延attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulat长半衰期降低生物活性),为了探讨究竟哪一种修ing life of bovine liver catalase [J]. J Biological Chem 1977, 252饰程度更适合对研制长效 rhIFN-B的要求,制备三(11):35823586种修饰程度不同的修饰物。选择凝胶过滤方法对(3)中国生物制品标准化委员会编中国生物制品规程200年版PEGl进行纯化纯度分析结果表明,达到了高度纯S〕.化学工业出版社,672化PEG1的目的。由于对PEG2、PEG3只是探索性[4] Habeeb AFSA. Determination of free amino groups in proteins by研究因而没有对它们进行高度纯化。PEG的修饰对 ThIFN-B的活性有影响,三种修饰物的比活性均5)田温姚文兵吴梧榈等,聚乙二醇对干扰素a2b的初步化有不同程度的下降,分别为修饰前 rhIFN-B的修饰研究〔中国药科大学学报2000,31(1):74793.53%48.69%、13.18%。当血FN-B结合一分中国煤化工CNMHG