不同添加剂对花生诱导分化的影响

广东农业科学2011 年增刊，72不同添加剂对花生诱导分化的影响温世杰'，童彩群2,罗虹， 梁炫强'(1.广东省农科院作物研究所，广东广州510640; 2.华南师范大学生命科学学院，广东广州510631)摘要:以花生 7日龄幼叶、胚轴和子叶为外植体,比较了其离体培养获得再生植株的能力,结果发现,7日龄幼叶具有良好的诱导分化能力。而在其诱导培养基中分别添加不同浓度的乙酰丁香酮(AS)、AgNO3和谷氨酰胺(GIn),比较各添加剂对花生诱导分化的影响,结果表明,AS为40mg/L时,诱导效果最佳,达93.08%;AgNO,浓度为1mg/L时,诱导率为90.63%。该研究结果为将来花生转基因研究提供依据。关键词:花生;组织培养;分化中圄分类号:565.2文献标识码:A文章编号:1004-874X(2011)25- -0072 -03Effect of different additives on peanut(Arachishypogaea L. )explants differentiationWEN Shi-jie', TONG Cai-qun', LUO Hong', LIANG Xuan- qiang'(1.Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agicultural Sciences, Guangzhou 510640, China;2.College of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)Abstract:The paper studied the better ability of differentiation on peanut explants, which were cut from the lealets,embryonic axes and cotyledons of 7-day -old seedlings. The results showed that the leaflets were better. To study the efectof different additives on the leaflets of 7 -day -old seedlings for the transgenimc of peanut in the future, differentconcentrations of AS, AgNO3 and CIn were added in the inductive medium. The results showed the medium supplement 40mg/L AS was the best, induction frequency of callus was 93.08%, and the medium supplement 1 mg/L AgNO3 was 90.63%.Key words: peanut(Arachis hypogaea L);plant regeneration diflerentiation花生(ArachishypogaeaL.)是我国主要油料作物1材料与方法和经济作物之--。花生组织培养作为生物技术育种的一个重要环节，其再生效率是研究人员最重视的指1.1试验材料标"。近年来虽然有不少以花生属植物的成熟胚、未成供试花生品种为广东省农科院作物研究所培育的熟胚凹、子叶节田、子叶图、胚轴5、幼叶16-7、 胚小叶8甚至珍珠红- -号。胚中段为外植物体的离体培养获得再生植株的报道,1.2 试验方法但是花生外植体再生效率，不仅与激素的种类和外植1.2.1外植体获取 花生 去壳后用蒸馏水冲洗3次,浸体有关,而且品种间也存在较大的差异。本试验基于前泡30 min。在超净工作台上用75%酒精消毒30s,无菌期的工作基础，对花生离体培养添加不同的外源添加水冲洗1~2次,0.1%(W/V)HgCl2消毒10 min,无菌水剂,探讨其对花生诱导分化的影响，为根癌农杆菌途径冲洗4~5次,用经灭菌的吸水纸吸去多余水分,接种至转化的花生转基因研究提供依据。1/2MS培养基上,25(+1)C下培养。7d左右,第1对真叶从子叶中伸出,切取未打开的叶片作为外植体。收稿日期:2011-11-15基金项目:国家自然科学基金(30971819 ,30900907);国家1.2.2试验设计前期基本确定了最佳诱导培养基现代农业产业技术体系建设专项(nyeyta-19);广东省自然科学(MSY)组成为:MS+10 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,培基金(10151064001000002 ,91510010000001);粤港关键领域养基的蔗糖浓度为3.0%,pH值为5.8,1219C高压灭菌重点突破项目(2008A024200009)20min。以MSY为对照,加入不同浓度的乙酰丁香酮作者简介:温世杰(1983-),男,研究实习员,E-mail:wenshiie(AS) AgNO3中国煤化工建及方法见表1。1983@163.com培养条件为::MHCNMHGh/d,光照强度通讯作者:梁炫强(1964-),男,博士,研究员,E -mail:Liang8044 000 lx。@yahoo.com73表1几种添加剂的添加浓度与方法添加剂添加剂浓度(mg/L)添加方法.无(对照组)AS2:在MS培养基高温灭菌冷却至60C后按比例添加AS4(AgNO3在诱导愈伤培养基灭菌冷却至60C后按比例添加AgNO3Gln在诱导愈伤培养基灭菌冷却至60C后按比例添加Gln基、相同的培养条件下,诱导的愈伤组织有差异,详见2结果与分析表2。7日龄子叶或胚轴组织产生的结实球状愈伤组2.1不同外植体的再生能力织的分化能力较差,而7日龄幼片愈伤组织状态最佳，如图1(彩插四)所示,不同的外植体在MSY培养出芽状况最好，芽诱导率约为85%。因此以珍珠红1A:7日龄花生幼叶长出的愈伤组织;B:7日龄子叶长出的愈伤组织;C:7日龄胚轴长出的愈伤组织图1不同花生外植体的诱导情况表2不同花生外植体的再生能力比较外植体类型切取部位及方法愈伤组织、芽的形态与质地芽诱导率7日龄幼叶 取下幼叶,切去四周的一圈，2~3d后叶片开始展开,7d左右伤口开始膨大，边缘开始出现黄绿色的愈切成0.2cmx0.5cm的小片伤组织,2周后可以看到在愈伤组织上有芽点或新的白色愈伤组织出现7日龄子叶取子叶 中部约0.5cm子叶切口边缘出现很多球状结实的愈伤组织，但分化特别慢,2个月后叶未分化出芽片的愈伤组织再生出小苗,子叶仍然是愈伤组织状态7日龄胚轴取靠近子叶的胚轴0.5cm胚轴产生的愈伤组织皆为白色絮状组织,没有分化能力,且切口分泌物质未分化出芽较多,呈褐色号的7日龄幼叶作为外植体较为合适。导率达90.63%,而提高AgNO3浓度至2 mg/L时,诱2.2不同添加剂对花生愈伤组织诱导率的影响导率反而下降到6.9%。当添加2 mg/L Gln时,诱不同添加剂(AS、AgNO3GIn)对花生愈伤组织诱导率为87.91%，当增加Gln的浓度至6 mg/L时,诱导率的影响结果见表3。几种外源添加剂均能有效导率下降到63.11%。提高花生愈伤组织诱导率,在MSY培养基中添加403结论与中国煤化工mg/L的AS诱导效果最佳。当逐渐加大AgNO3和GIn的浓度时，对诱导愈伤组织是不利的。外植体对外植体YHCN M HC植物组织培养的AgNO3反应极为明显，当添加1 mg/L AgNO3时,诱三大要素,本研究结果表明,选用7日龄幼叶为外植体74表3不同添加剂对 花生愈伤诱导率的影响添加物浓度愈伤组织诱导率添加物愈伤组织质地与大小的差异(mg/L)(%)无(对照组)白色絮状或黄绿色结实块状，量较少57.89AS25白色絮状或黄绿色结实块状，分布在切口四周,愈伤组织量多,且多为白色85.941093.08AgNO3白色絮状,中间夹带点褐色,愈伤组织量较多,分布于切口四周90.63白色絮状,少有黄绿色块状,只在切口的某一处长出一点66.99Cln白色絮状或黄绿色结实块状分布在切口四周,愈伤组织量较多87.9184.4463.11具有良好的诱导效果。在植物组织离体培养过程中,容3] DENG Xiang yang,ZHI Ming wei,HAI Long an.Transgenic易产生乙烯并逐渐积累，而乙烯的积累使得外植体分peanut plants obtained by particle bombardment via化受到影响或毒害。Ag*是一种较好的乙烯活性抑制somatic embryogenesis regeneration system[J].Cell Research,2001,11(2): 156-160.剂,培养基中添加AgNO3能有效地抑制乙烯形成,减4] Swathi Anuradha T,Jami S K,Dala R S,et al.Genetic少或消除乙烯对细胞生长的不利影响。有学者指出transformation of peanut(Arachis hypogaea L. )usingAgNO3是竞争性地作用于乙烯作用部分从而促进器官cotyledonary node as explant and a promoterless gus :nptII发生,提高细胞的再生能力心。AgNO,对花生离体培养fusion gene based vector[J]J. Biosci, 2006 ,31(2):235- -246.有明显的作用,但是不同外植体源对AgNO3促进器官5] Kiran K S,Vanamala A. An eficient method for the发生和产生毒害的剂量存在差异叫。谷氨酰胺(GIn)是production of transgenic plants of peanut (Arachis hypogueaL. )through Agrobacterium tumefaciens -mediated genetic tran-合成生物体内极其重要的抗氧化剂一还 原型谷胱甘sformation[J].Plant Science 2000,159:7-19.肽(reduced glutathione ,GSH)的前体物质叼，是构成蛋6] 林荣双,梁丽琨.花生成熟胚胚轴的植株再生和快繁[]生物白质中氨基酸和合成含氨生物物质的氮源，与组织生技术,2003, 13(1):29- -31.长和修补有密切的关系，在生命活动中起重要作用31。7]李艳,李少雄,周桂元,等.花生幼叶丛生芽的诱导和高效再研究表明加人适当浓度的Gln对外植体的褐化现象有生体系的建立[].广东农业科学,2006(7): 14-16.抑制作用，但是不同外植体对其作用的最佳浓度也有8]庄东红,周敏,郑奕雄花生幼叶芽诱导和植株再生研究[].中国油料作物学报,2001 ,23(3):13-15.差异。从本试验结果来看,当添加1 mg/L AgNO3或29]温世杰,刘海燕,梁炫强.胚中段为外植体的花生高效再生mg/LGln时,花生外植体诱导分化的效果较佳,愈伤组体系构建研究[J].花生学报,2010,39(2):29 -32.织诱导率分别为90.63%和87.91%;在添加40 mg/L[10]张鹏,傅爱根.AgNO3在植物离体培养中的作用及可能的机AS时,可以达到最佳的诱导效果,这可为花生转基因制[].植物生理学通讯, 1997 ,3():376- 379.研究提供参考。[1]周蓉,陈小媚.AgNO3对花生离体培养芽再生的作用[].花生科技, 99(S):257 -260.参考文献:[12] Harward T R,Coe D,Souba W W. Glutamine1] 方小平,许泽义,张宗义,等.花生小叶外植体植株再生及农gutdlutathione levels during intestinal ischemika reperfusion杆菌介导的基因遗传转化[J].中国油料,1996,18(4):52-56.IJ Surg Res, 1994,56:351-354.2] Ihson I,Robina S,Mussarat J Plantlet regeneration from[13]陆维玮,沈亚领,王树力.谷氨酰胺的研究及开发进展[].中mature embryos of peanut (Arachis hypogaea L) []国生化药物杂志,1998, 19(3):161-163.Pakistan Jourmal of botany , 1995 ,27(2):405- -409.中国煤化工MYHCNMH G