用于RAPD分析的鱼类血样乙醇保存方法的研究

淡水渔业》1998年第28卷第2期用于RAPD分析的鱼类血样乙醇保存方法的研究张德春杨代淑李晓迎张锡元’余来宁方耀林(武汉大学生命科学院,武汉43002)(长江水产研究所,荆州43400摘要从乙醇保存的白鲢血液中提取基因组DNA,经琼脂糖凝胶电泳分析的紫外检测表明:其大小和纯度与冷冻保存的白鲢血液提取的基因组DNA相当。以从乙醇保存和冷冻保存的同一条白鲢血细胞提取的基因组DNA为模板,用4种随机引物分别进行RAP扩增,结果显示两种保存方法获取的基因组DNMA的每一种引物所扩增的带型都相同关健词鱼类,基因组DNA,RAPD随机扩增多态DNA( Rondon Amplified是野外采集)中常用的冷冻保存样品的方法lymorphic DNA,RAPD)技术是1990年由不仅麻烦,而且还受各种条件的限制,保存Wiliams等和Wlsh等两个小组同时建立发的时间也不宜过长。针对采样和实验的需展起来的,它具有以下优点:(1)技术比较要,我们研究了用乙醇保存鱼类血样提取合简单,无需制备克隆、同位素标记和分子杂乎要求的基因组DNA的方法,用于RAPD交等;(2)灵敏度高,可提供足够丰富的多分析,取得了满意的效果。态性;(3)对模板DNA纯度要求不高;(4)1材料和方法成本较低。RAPD技术产生的时间不长,但1.1材料白鲢购自武汉市水果湖市场该技术已广泛应用于生物领域的各个方面。2材料处理活鱼经尾静脉取血,血液提取鱼类基因组DNA常用组织多为肝中加入1/6体积的ACD抗凝剂(0.48%柠檬脏、肌肉、生殖腺等,取血样提DNA的方酸,0.32%柠檬酸钠,1.47%葡萄糖),混法较少使用。我们已作的研究证明,以鱼类匀。一部分血液-20℃保存;一部分血液加的血细胞作为提取基因组DNA的材料可以人无水乙醇至终浓度为70%,混匀,静置,不伤害鱼本身,并由于鱼类外周血细胞有分散的血细胞颗粒沉降下来,室温放置核,在介质中处于分散状态,去除蛋白质和1.3基因组DNA的提取RNA比较容易,花费较少就能获得纯度较1.3.1乙醇保存血液的基因组DNA的提取高的DNA,表明这一方法具有很大的优越取200u血细胞颗粒乙醇悬浊液于1只性(另文发表)。但是,在采集标本(特别1.5 ml Eppendorf管中。3.500×g离心3min,本工作得到国家自然科学基金(3960582)的资助+联系人稿日期:997-11-18。沉淀用lm0.8%Nac悬浮沉淀,重复45每个循环包括94℃变性40S,36℃退火505次。沉淀加入10010.8%Nad悬浮,再加入72℃延伸1.%min。首次循环前于94℃预变400 hul dnA抽提缓冲液(10mmo/ L Tris-HC,性5min,最后一个循环后于72℃延伸5min00m/LEDA,0.5%Ss,p8.0),加扩增片段用1.2%琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml蛋白酶K至终浓度为10ug/m,55℃消化溴化钇)电泳1.5h(sVcm),紫外灯下观4-6h。用等体积酚/氣仿/异戊醇(25/24/察拍照l)抽提。离心后上清用2倍体积预冷的无2结果水乙醇沉积DNA。用70%乙醇洗涤DNA沉2.1基因组DNA的电泳图谱(图略去)淀2次后,将DNA空气干燥,用适量TE2.2基因组DNA的紫外吸收lOmmol/L Tris-HCL, ImmoL/L, EDTA测定冷冻保存血液和乙醇保存血液提取pH8.0)溶解,并调整DNA浓度至大约的基因组DNA的紫外吸收,其Axo/A>o值25ng/山,4℃保存。分别为178和1.76,均大于17513.2冷冻保存血液的基因组DNA提取23,基因组DNA的RAPD扩增结果冷冻血液室温融解,取100udl于F分别用OPM-9,OPM-10,OPM13endorf中,加人1m0.8%,Nad,混匀,离OM-19(0 peron Technologies公司出品)四心,乳白色沉淀用100ul0.8%Nal悬浮,再种引物对冷冻保存和乙醇保存血液提取的基加人400dDNA抽提缓冲液,加蛋白酶K至因组DNA进行扩增。四种引物在两组基因终浓度(80y/m),55℃消化2-4h后,抽组DNA中都得到了相同的扩增效果。提。DNA沉淀洗涤后溶于TE,调整浓度至3讨论25g/d左右,4℃保存。基因组DNA的质量与RAPD的扩增效14冷冻保存血液和乙醇保存血液的基因果直接有关。在我们这项实验中中,乙醇保DNA的琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收的测定存血液所提取的基因组和冷冻保存血液提取1.4.1琼脂糖凝胶电泳的基因组DNA的片段大小一致,没有RNA采用07%琼脂糖凝胶(含0.5/m溴污染;两组基因组DNA的Ao/Ax值均大化钇锭)电泳lh(5v/(cm),紫外灯下观察于175,表明DNA样品中没有显著的蛋白拍照。质污染,适于RAPD分析。乙醇保存血液和1.4.2紫外吸收的测定冷冻保存血液提取的基因组DNA在其它条在波长260m、280mm下测定基因组件相同的情况下,对同一种引物扩增的谱带DNA的紫外吸收。是相同的,说明用乙醇保存鱼类血样不会影.5RAPD分析响RAPD分析的扩增效果,但在野外用乙醉在其它条件相同的情况下,分别以冷冻保存血样和冷冻保存血样相比,具有明显的保存血样和乙醇保存血样所提取的基因组优点:(1)方便、简单、便于携带。冷冻保DNA为模板,进行RAPD扩增。RAPD反应存血样比较麻烦,而用乙醇保存则十分方总体积为25,含10mml/ L Tris-BC;便,有利于野外大量样品的采集;(2)可较pH83;50mLKl;3/omm/LM2;长时间保存样品;(3)成本低。000明胶;20umo/ L dNTPs;0.24um/L冷冻保存血液室温融解后,大部分细胞引物;25 ngDNA模板和15单位 Taq dNA聚膜已破,细胞质中的大量蛋白质经离心而除合物(华美生物工程公司)。反应混合物覆去,沉淀主要在细胞核,蛋白质含量较少,盖一层石蜡油。反应过程包括45个循环,用少量蛋白酶K吧/ml)在较短时间(24h)内就能彻底消化,所需酚抽提的次数也(48h),同时,需要多次酚抽提才能充分很少。用乙醇保存血液提取DNA时,首先除掉蛋白质。要充分除去乙醇,否则将影响蛋白合乎K综上所述,乙醇保存血液提取的基因组的作用;由于细胞质中的蛋白质在加入DNA的质量及RAPD扩增效果和冷冻保存血DNA抽提缓冲诊前没有除去,并由于乙醇液提取的基因组DNA是一致的,这为野外的作用而凝缩变性,因而消化所需蛋白酶K采集样品提供了一个简单、方便的途径要多些(200g/ml),消化时间也要长些优质鱼苗鱼种广州龙归鱼苗场为您提供1.台湾单雄性吴郭鱼2.奥尼罗非鱼3.珍珠粒花鯛(红色罗非鱼)4.淡水白鲳5.美国叉尾鲜6.大口鲶、鳜鱼、加州鲈、彭泽鲫、本地胡子鲶等苗类鱼苗品质纯正价格优惠,欢迎各地朋友来人来电或来函洽谈购买,我们热诚为客户提供一切便利服场址:广州市白云区龙归镇南岭邮编:510445场长:戴惠田电话:(020)86269121392325970神矿速南蓝华业青公司a就罗非、颈水白■到菌海南胜华渔业有限公司是海南岛内从事于鱼苗鱼种生产和研究的专业化渔业公空司,一直以“客户至上,质量取胜”为宗旨,以求实、高效的作风与全国广大的户保持长期稳定良好的合作,每年提供奥尼罗非鱼(雄性率85%以上),淡水白纟王等鱼苗鱼种90多万尾。同时,独家代理海南(台湾)益华水产公司繁殖的单性罗非鱼苗鱼种(雄性率%5%以上)。在新的一年里,我们将一如继往地为广大客户提供质优价廉的鱼苗鱼种和良好的服务,真诚欢迎广大客户莅临现场参观指导公司地址:海南省海口市白沙门下村57号联系人:任小姐、舒小姐电话;(0898)6275684邮编:5708B机(中文):(081891-38936手机:(0)1397562650)1397564295开户行:海南省海口市海联信用社海甸分社帐号:201|-1042