响应曲面法优化大粒车前子苯乙醇苷乙醇回流提取工艺

第39卷第4期南昌大学学报(理科版)Vol 39 No 42015年8月Journal of Nanchang University( Natural Science)Aug.2015文章编号:1006-0464(2015)04037404响应曲面法优化大粒车前子苯乙醇苷乙醇回流提取工艺万茵,梁玉禧,李益珍ψ,邹彬·,皮璟渔1:2,张伦宁3,聂少平l,谢明勇1(1.南昌大学a.食品科学与技术囯家重点实验室;b.食品学院2.江西省药物研究所,江西南昌330029;3.萍乡市食品药品检验所,江西萍乡337055)摘要:在单因素试验的基础上,研究提取温度(℃)、乙醇体积分数(v·v1)及液料比(mL·g1)等因素对苯乙醇苷类提取得率的影响,优化车前子苯乙醇苷的乙醇回流提取工艺。应用 Design-Expert.8.0.6软件进行响应曲面分析,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。苯乙醇苷的最佳提取工艺条件为温度90℃、乙醇体积分数71%、液料比47mL·g-1,在此条件下苯乙醇苷的提取得率为0.99%,与模型预测值1.02%吻合良好。优化后的工艺参数可为乙醇回流提取大粒车前子中苯乙醇苷的产业化提供指导关键词:响应曲面法;大粒车前子;苯乙醇苷;乙醇回流提取中图分类号:R283.6文献标志码:AOptimization of ethanol reflux extraction of phenylethanoid glycosidesfrom Semen Plantaginis with Response surface techniqueWAN YinlaIb LIANG Yuxi b. LI Yizhen b, ZOU Bina, Ib. PI Jingyu,2ZHANG Lunning, NIE Shaopinga, XIE Mingyong(la. State Key Laboratory of Food Science and Technology. Nanchang University, Nanchang 330047. China;1b. College of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, ChinaIc Sino-German Food Engineering Center, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Jiangxi Instituteof Materia Medica, Nanchang 330029, China; 3. Institute for Food and Drug Control, Pingxian 337055, China)Abstract: The study was aimed to optimize the ethanol reflux extraction conditions of phenylethanoid glycosides from Semen Plantaginis. Three factors such as extraction temperature (C), ethanol concentration(%)and ratio of solvent to material (mL .g) were investigated on the basis of single-factor experiments. The predictive equation was obtained by fitting the experimental data to the box-Behnken Design( BBD)model with Design- Expert.8.0. 6 software. The results showed that the optimum ethanol extractionconditions were optimized extraction temperature 90C, ethanol concentration 71 and the ratio of solventto material 47 mL .g. Under these conditions, the mean extraction yield of phenylethanoid glycosideswas0.99%, which was in good agreement with the predicted model value 1. 02%. The optimized parame-ters could provide the guidance on the industrialization of ethanol reflux extraction of phenylethanoid glycosides from Semen plantaginisKey words: response surface methodology Semen Plantaginis; phenylethanoid glycosides; ethanol reflux extraction苯乙醇苷类化合物是指以β葡萄糖为母核,通生物,有羟基、甲氧基取代的酰基或糖基的一类天然过糖苷键连接羟基、甲氧基等取代的苯乙醇及其衍糖苷,通常含有酯键及氧苷键,结构通式见图1。研稿日期:2015-03-20。第4期万茵等:响应曲面法优化大粒车前子苯乙醇苷乙醇回流提取工艺究表明,苯乙醇苷类化合物具有广泛而且显著的生仪器有限公司),DFY-500摇摆式高速万能粉碎机理活性,如免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗诱变、抗炎、(温岭市林大杋械有限公司),旋转蒸发仪RE-52抗菌、抗肿瘤、增强记忆、抗血小板、保肝强心等作(上海亚荣生化仪器厂),DHG-9053型电热恒温用-2,是多种药品和保健食品的主要有效成分鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司),SHBⅢ循环水式真空泵(杭州瑞佳精密科学仪器有限公司),UV-7504单光束紫外一可见分光光度计(上R海精科实业有限公司)。2实验方法诸多因素影响乙醇回流提取大粒车前子中苯乙图1苯乙醇苷类化合物的结构通式醇苷的提取得率,如大粒车前子的粉碎度、液料比、乙从自然界分离得到的苯乙醇苷类化合物主要存醇体积分数、提取温度、提取时间和提取次数等。通在于双子叶植物中,如列当科、玄参科、木樨科、木兰常乙醇回流提取有效成分时,提取2次可以将大部分科、蔷薇科、爵床科、菊科、苦芭苔科、马鞭草科和唇形有效成分提取出来,提取2次以后得率提高不大,从节约成本和提高产能考虑,本实验将提取次数定为2科等植物中3,近年来不断有报道从小檗科、车前科马齿苋科等多种植物中提取出苯乙醇苷类化合物。次。选择其他因素进行单因素试验,根据结果选取影响显著的因素分别设置3个水平进行响应面优化,获车前子( Semen plantaginis),又名车前实、虾蟆衣子、猪耳朵穗子、凤眼前仁,为多年生草本车前得车前子苯乙醇苷的回流提取最佳工艺条件2.1苯乙醇苷含量的测定科植物车前( Plantago asiatica L.)或平车前2.1.1标准曲线的绘制精密称取10mg毛蕊花( Plantago depressa willd的干燥成熟种子,前者称为大粒车前,后者又称小粒车前。车前子是江释至刻度,摇匀,得到浓度为1.0mg,mL的标准西省道地药材之一,味甘性寒,入肾、膀胱、肝、肺经,溶液。然后依次吸取1.0,2.0,2.5,3.0mL于4个功能利水通淋、渗湿止泻、清肝明目、清热化痰,药用10mL容量瓶,定容,得到浓度为0.10,0.20,0.25价值显著。近年来研究发现来源丰富、价格低廉的0.30mg·mL-的标准溶液。分别吸取5个不同浓车前子中含有较高的苯乙醇苷化合物。度的标准液400μL,各加入0.5mol·L.盐酸溶液苯乙醇苷属于极性化合物采用乙醇回流提取,2mL、10%亚硝酸钠溶液0.4m1L、10%钼酸钠溶液具有高得率、工艺操作简便的特点。因此本文采用1.6mL和2mol.L-1氢氧化钠溶液2mL,蒸馏水单因素实验和响应曲面法对大粒车前子中苯乙醇苷定容至10mL,摇匀,静置显色10min后在波长525的溶剂回流提取条件进行优化,得到车前子苯乙醇m下测定吸光度值,并以吸光度值A为纵坐标、毛苷的回流提取最佳工艺条件,这对产业化生产苯乙蕊花苷浓度C为横坐标绘制标准曲线。得到线醇苷具有现实意义性回归方程如下1材料与仪器A=1.0918C-0.0582R=0.9991(1)可见毛蕊花苷质量浓度在0.1~1.0mg1.1原料mL1与吸光度值呈良好的线性关系大粒车前子( Seeds of Plantago asiatica I.),2.1.2总苯乙醇苷的提取及得率测定精密称取产自江西吉安。5g车前子粉末置于圆底烧瓶内,加入乙醇进行回1.2试剂流提取,过滤,滤液滅压浓缩定容至100mL。再精乙醇、石油醚(60~90℃)、正丁醇、盐酸、氢氧密吸取400,L,根据2.1.1的方法进行显色反应,化钠、钼酸钠、亚硝酸钠,以上均为国产分析纯;甲10min后在525mm下测量吸光度值,根据公式(1)醇,为国产色谱纯;毛蕊花苷标准品(纯度≥98%),计算苯乙醇苷的质量浓度,再根据公式(2)和(3)计购自中国药品生物制品检定所。算提取液中苯乙醇苷质量和苯乙醇苷提取得率:南昌大学学报(理科版)2015年V为定容体积(mL)。变量选择3个水平,分别以-1、0、1进行编码.以苯苯乙醇苷提取得率/%=苯乙醇苷含量(ng)×乙醇苷得率Y为响应值,利用 Design-Expert100%/M(mg)(3)8.0.6软件对试验结果进行回归拟合分析。式中:M为车前子原料质量(mg)2.2单因素试验3结果与讨论2.2.1粉碎度车前子粉碎,过不同目筛,得到203.1单因素试验结果40日、40~60日、60~80日、80目以上这4种不乙醇回流提取苯乙醇苷单因素结果见图2。同粉碎度的样品。精密称取这4种车前子粉各5g由图2(a)可知,在粉碎度单因素试验中,粉碎按10:1的液料比加入75%乙醇溶液,分别于80度为40~60目和60~80目时苯乙醇苷提取得率相℃加热回流2h,抽滤,滤渣依样进行第2次提取,抽差不大,且均明显髙于其他粉碎度。提取过程包括滤,合并两次滤液,浓缩定容,按2.1.2方法测定提扩ˆ散、渗透、溶解、吸附等复杂过程,粉碎度越大颗粒取液吸光度值,计算苯乙醇苷提取得率,比较不同粉越小,可增加固液传质表面积,苯乙醇苷越容易溶碎度对苯乙醇苷提取得率的影响。出,提取效率越高,但是原料粉碎度越大,粉碎的成2.2.2乙醇体积分数精密称取4份车前子,每份本也越高,且颗粒太小提取时容易带出大量黏性多5g粉碎度参照2.2.1结果,按10:1的液料比加糖,增加固液分离难度,为简化后续操作,因此选定入不同体积分数的乙醇溶液(25%,50%,75%,40~80目为最佳粉碎度粉碎度。%),分别于80℃加热回流,提取时间与次数同乙醇体积分数单因素试验结果见图2(b),结果2.2.1,按2.1.2测定提取液吸光度值.计算苯乙醇表明乙醇体积分数为75%时出的苯乙醇苷提取得苷提取得率,比较不同乙醇体积分数对苯乙醇苷提率最高,100%次之,25%和50%均更低。其原因是取得率的影响。苯乙醇苷的分子结构是羟基苯乙醇基以糖苷键连接2.2.3液料比乙醇体积分数精密称取4份车前到β吡喃葡萄糖上·随着乙醇体积分数升高,溶剂极子,每份5g,粉碎度参照2.2.1结果,按不同的液料性降低,更易溶解在高浓度的乙醇水溶液中。且比(10:1,20:1,30:1,40:lmL·g-)加人乙醇低浓度的乙醇水溶液易提取出多糖,导致提取液的溶液(乙醇体积分数参照2.2.2结果),分别于80℃粘度加大,增加过滤的难度。过高乙醇浓度不仅会加热回流,提取时间与次数同2.2.1,按2.1.2测定降低提取率,也会提取出一些醇溶性杂质,因此选择提取液吸光度值,计算苯乙醇苷提取得率,比较不同75%的乙醇体积分数作为响应面试验中的编码θ进液料比对苯乙醇苷提取得率的影响。行后续试验。2.2.4提取温度精密称取4份车前子,每份5g,液料比单因素试验结果见图2(c),结果显示,粉碎度参照2.2.1结果,乙醇体积分数参照2.2.2随着液料比的不断增大.苯乙醇苷提取得率也在不结果,液料比参照2.2.3结果,分别于不同温度下断提高,且组间差别明显。根据费克定律可知,传(20℃,40℃,60℃,80℃)加热回流,提取时间与质效率与溶质的浓度梯度呈正比,液料比越大,液固次数同2.2.1,按2.1.2测定提取液吸光度值计算两相中的溶质浓度梯度越明显,有利于溶质的溶出苯乙醇苷提取得率,比较不同提取温度对苯乙醇苷增加苯乙醇苷提取得率。但考虑到节约成本和后续提取得率的影响。操作处理等综合因素,为避免浓缩工艺操作负荷过2.2.5提取时间精密称取4份车前子,每份5g,大和能耗过高,故选择液料比40mL·g作为响应粉碎度参照2.2.1结果,乙醇体积分数参照2.2.2面试验中的编码0进行后续试验结果,液料比参照2.2.3结果,提取温度参照2.2.4提取温度单因素试验结果图2(d)表明,随着温结果,加热回流不同时间(1,2,3,4h),次数同2.2.度升高,苯乙醇苷提取得率得率不断增加,且增加幅1,按2.1.2测定提取液吸光度值,计算苯乙醇苷提度明显,由此可知温度是影响苯乙醇苷得率的主要取得率,比较不同提取时间对苯乙醇苷提取得率的因素。由于温度升高,分子热运动加快,增加溶剂扩影响。散速度和溶质溶出速度,提高提取效率。但是温度2.3响应曲面优化试验过高不仅能源消耗高,还容易使苯乙醇苷活性下降。第4期万茵等:响应曲面法优化大粒车前子苯乙醇苷乙醇回流提取工艺377提取时间单因素试验结果见图2(e),提取时间0.9770.9860.999从1h增加到2h,苯乙醇苷提取得率变化明显,而提取时间超过2h之后苯乙醇苷提取得率开始趋近于平缓,过长的高温提取时间,不仅能耗高而且会对蜜0.6苯乙醇苷提活性造成不利影响,由此选取提取时间2h为宜。综上所述,选取了对影响乙醇回流提取大粒车0-4040-6060-80≥80前子中苯乙醇苷提取得率影响显著的3个因素,即e)提取时间/h乙醇体积分数、液料比和提取温度图2乙醇回流提取单因素试验结果(n=33.2响应曲面试验结果表1乙醇回流提取实验因素与水平对照表根据单因素的试验结果,响应曲面试验因素与因素水平选择如表1所示,3个因素中,乙醇体积分数为水平A乙醇体积分数/B液料比/C温度/(mlA、液料比为B、温度为C。750.6060.6430.60.60.546表2为不同条件下所测得的苯乙醇苷得率,利0.4用 Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行多元回归拟合,得到乙醇体积分数(A)、液料比(B)、温度(C)与苯乙醇苷得率(Y)之间的二次多项回归方程20~4040~6060~80≥80为:Y=+0.93-0.11×A+0.091×B+0.20×C+(a)粉碎度/目0.076×AB-0.072×AC-0.063×BC-0.17×A20.7370.7080.030×B2-0.19×C2。621份0.6表2 Box-Behnken设计方案及实验结果(n=3)翠04编码水平试验号苯乙醇苷出C得率/00.930b)乙醇体积分数/%1234567890.8690.9550,9300.790.8260,34510.931职0610.382040.9300.9300.858液料比/(mL·g-1)2345670.94经过方差分析得到表3数据。显著性检验结果0.662表明,该模型的P值<0.0001,自变量一次项A骂0.6B、C和二次项A2、C2均差异极显著,二次项AB、0.269AC、BC差异高度显著,表明该模型选用的二次项模型具有统计学意义;拟合度R2=0.9940,表明预测南昌大学学报(理科版)2015年的模型,说明回归方程能切实解释各因素与响应值的交互作用越显著,椭圆排列越密集,则表明因素的间的真实关系,具有高拟合度、可信度,可用来对乙变化对响应值变化的影响越大1。由这3组图可醇回流提取车前子苯乙醇苷的得率进行预测ˆˉ。知,从响应曲面坡度来看,温度的影响大于乙醇体积响应面图和等高线图直观地反映了任意2个因分数,乙醇体积分数的影响又大于液料比,从等高线素对苯乙醇苷得率的影响,它是将建立的回归模型图形状来看,两两因素间相互作用均比较明显。中其余2个因素固定在0水平所得到的,具体交互3.3验证试验及结果影响结果见图3。在响应面图中,如果响应曲面坡经过优化后,得到提取最优条件为温度89.3度若越陡峭,则表明响应值越敏感。在与响应面对℃、乙醇体积分数71.1%、液料比47.1mL·g应的等高线图中,曲线离中心越近,对应的响应值也考虑到实际条件,修正工艺参数为温度90℃、乙醇越大,若等高线形状越呈椭圆形,表明2个自变量间体积分数71%、液料比47mL·g-。按照修正工表3方差分析结果方差来源平方和自由度均方差Prob>F显著性模型0,0950.098<0.0001ABCA0,0670.06789.85<0,0001关著爷0.33441.41<0.00010.02331AC0.0200.0200.00120,0160.13171.46<0.0001第ABC残3,727E003.727E0035,030.05990.15204.49<0.00017,414E004拟5.189E0031.730E003纯误差0,0000.86拟合度R2=0.9940校正拟合度R3;=0.9862信噪比=29.977注:“*差异极显著,P<0.001;*差异高度显著,P<0.01;*差异显著,P<0.05;◎非显著,P>0.0545.0040.00B:液料比300600600:乙醇体积分数C:温度608苯乙醇苷得率00604醇体积分数50.00苯乙醇苷得率100.00土实76.0030.00600066.00720078.0084.0090.0068.00A:乙醇体积分数60.006,0072.00780084.0090.00第4期万茵等:响应曲面法优化大粒车前子苯乙醇苷乙醇回流提取工艺379参考文献[1 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Innovative Food Science & Emerging枇杷叶紫珠,但车前子在江西分布广泛,具有来源易Technologies,2009,10(4):610-615.得、相对价格低廉的优势,其生产成本远低于肉苁蓉〖12]任璐,顾小红,汤坚.栽培管花肉苁蓉中苯乙醇苷的乙和枇杷叶紫珠。而且除苯乙醇苷外,车前子还含有醇提取工艺[].食品与生物技术学报,2006,25(3)大量的多糖、黄酮等其他活性成分,综合利用价33-36值显著。本研究优化后的工艺参数,运用到乙醇回13]巩珺,麦锦富,彭素萍,等, Doehlert设计法优化紫珠流提取大粒车前子中苯乙醇苷的实际生产中,对提中苯乙醇苷的提取工艺[J.中国实验方剂学杂志高苯乙醇苷产品得率、降低生产成本具有重要指导2011,17(17):7-10[14]何永婷,朱贺年.车前子的研究进展[J.北方药学