纤维素酶在燃料乙醇工业中的应用研究进展

酿酒科技2009年第3期(总第177期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2009No3(Toll77)纤维素酶在燃料乙醇工业中的应用研究进展景春娥,赵旭,常思静,薛林贵(兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070)要:现代社会面临着严重的能源危机,发展燃料乙醇作为化石燃料的替代品已经成为国际上的共识。归纳了乙醇生产原料选择方面的关键问題,总结了微生物直接转化、同步糖化发酵、糖化发酵二段法以及固定化细胞发酵等生物转化方式的主要研究进展,在此基础上对我国利用纤维质原料生产乙醇的研究前景进行了展望,旨在为开展同类工作提供理论依据。关键词:燃料乙醇;纤维素酶;应用;研究中图分类号:Q814;TS2622;TS2614文献标识码:A文章编号:1001-9286(2009)03-0098-05Research Progress in the Application of Cellulase in Fuel Ethanol IndustryJING Chun-e, ZHAO Xu, CHANG Si-jing and XUE Lin-gui( College of Chemical and Biology Engineering, Lanzhoujiaotong University, Lanzhou, Gansu 730070, China)Abstract: We are facing serious energy crisis now and the development of fuel ethanol as a substitute for fossil fuels has become an intemationalonsensus. In this paper the key issues on the selection of raw materials for fuel ethanol production were discussed and the research progress inconsolidated bio-processing, simultaneous saccharification and fermentation (SSF), separate hydrolysis and fermentation(SHF)and immobilizedcell fermentation was summarized. In addition, the development of using cellulose materials to produce ethanol in China was reviewed, so as toprovide theoretical evidence for conducting similar study in the futureKey words: fuel ethanol; cellulase; application; research燃料乙醇,指没有添加变性剂的、可以作为燃料使用化发酵二段法、固定化细胞发酵做了综述。的无水乙醇,它具有和矿物质相似的燃烧性能。燃料乙醇1适合规模化生产的原料选择添加变性剂后,与无铅汽油按一定的比例混配,可以形成种新型绿色燃料:乙醇汽油,即用90%的普通汽油与生产燃料乙醇,一种是采用淀粉质原料,另一种是采10%的燃料乙醇调和而成。与汽油燃料相比,纤维素乙用糖质原料。淀粉质原料有薯类和谷类等农副产品,以美醇燃料可减少86%的温室气体排放,最多可减少96%。国为代表采用的是玉米为原料的生产方式。糖质原料主因此,目前关于燃料乙醇的开发和研究在国内外都受到要有甘蔗和甜高粱等农副产品,以巴西为代表采用的是了高度重视,各国政府都出台相应措施以实现能源的再甘蔗为原料的生产方式。目前,以玉米为原料生产乙醇在生田。目前的研究主要集中在以下几个方面:就乙醇生产世界乙醇发展中占主导地位。但是用玉米生产乙醇对食原料方面,传统的方式是以玉米等粮食作物为主的生产。品和饲料价格的上升有一定影响,引发了诸多争议,并且但是,在温室气体排放方面,纤维素乙醇燃料比传统的粮替代石油的潜力有限因此国际各相关科研机构积极开食乙醇燃料更环保。目前坚持利用边际性土地、与生态发新的原料资源,使生物燃料更加完善和可行。不仅考虑恢复相结合发展能源作物的原则。大量的种植木质原料如下几个方面:①农业废弃物如麦草、玉米秸秆、玉米可以解决生产燃料乙醇原料的问题,而且能源作物种类芯大豆渣、甘蔗渣等;②工业废弃物,如制浆和造纸厂的筛选及品种改良至关重要就转化过程而言,预处理方法纤维渣锯末等③林业废奔物:④城市废弃物如废纸、的优化以及纤维素酶成本的降低和效率的提高是生产生包装纸等而且种植有效生产乙醇的木质原料。物质乙醇的关键。就发酵方式而言,统合生物工艺即直接11甜高梁用微生物转化是最理想的发酵方式。本文对适合于规模高粱具有高能效、高产、耐干旱和适合边际性土地种化生产的主要原料微生物直接转化,同步糖化发酵糖植、牛基金项目:国家自然科学基金賁助項目(No30870384);甘肃省自然科学基金资助H中国煤化工成为潜力巨大的能源CNMHG收稿日期:2008-12通讯作者:薛林贵,男教授研究生导师E- mail:xue@m景春娥,赵旭,常思静,薛林贵·纤维素酶在燃料乙醇工业中的应用研究进展作物,尤其是甜高粱既能生产高粱米用于食品和饲料,研究了盾叶薯蓣发酵生产乙醇的液化、糖化及发酵工艺又能在茎秆中产生糖用于生产乙醇。因此,甜髙粱制取生条件。结果表明,盾叶薯蓣的淀粉利用率为97%,淀粉出物乙醇技术研究成为生物燃料行业的焦点。根据我国的酒精率为535%最终酒精度为78%Vol实际情况,大规模发展以玉米为原料的燃料乙醇有一定1.4柳枝稷难度。而我国拥有数千万公顷的盐碱地,通过改良用来种柳枝稷是禾本科,多年生丛生型禾草,耐旱、耐高植甜高梁。国内已自主研发了甜高粱茎秆转化燃料乙温、排水不良的土壤环境。由于能够从柳枝稷中提炼出乙醇的技术,并在黑龙江、山东、新疆、内蒙等省区进行了甜醇所以其有“能源草”的称谓。美国研究认为柳枝稷具高粱种植以及燃料乙醇生产试点,但其转化为乙醇的技有很高的生物产量,而且在水土保持和草地改良方面具术需要进一步改进才可进行商业化生产试验围。河北省有优势是其本土最具前景的能源作物。1992年美国建立农林科学院2005年育成的早熟甜高粱新品种——能饲了18个大田试验点种植了8个柳枝稷品种。美国能源1号、能饲杂1号,示范区内出现了每667m2产秸秆部资助了柳枝稷遗传育种研究,培育的第一个品种为7000kg糖锤度最高达22Biⅸ的高产典型王莹吲等介 Shawnee,其他品种将于近10年陆续审定。中国农业大绍了甜高粱原料保藏、发酵制取乙醇的高效菌株选育、酵学程序教授于2005年专程赴美考察能源作物,引进了母细胞固定化发酵条件优化、产业化开发与副产物综合 Shawnee和 Trailblazer2个品种,并在我国北方开始了试利用等甜高粱茎汁乙醇发酵技术的研究与应用进展情种。中国农业大学资源与环境学院教授胡林等专家完况。在美国休斯敦召开的高粱生物燃料国际会议上李十成的一份研究报告显示,如果能把适合种植的361万公中教授的“甜高粱秆先进固体发酵技术"被确认为是实现顷荒草地用于种植生物乙醇能源植物,毎年潜在的生物高粱生物燃料商业化和可持续生产生物燃料的关键技术乙醇产量可达1100万t,可替代当今中国汽油消费的23途径之一。从目前的研究状况可知,甜高粱替代玉米%。研究表明,为了提髙发酵性糖类的产量.对柳枝稷的生产乙醇势在必行。预处理是必需的,预处理后,水解产生的葡萄糖的产量从1.2海藻70%上升至90%,木糖产量从70%上升至100%,发酵海藻是生产生物燃料最有前途的来源之一。与食品后乙醇产量从72%达到了92%的理论最大值。类作物或纤维素材料相比,某些海藻可自然地产生和集2纤维素糖化发酵方式聚,并可在生长过程中通过吸收利用氮氧化物和二氧化碳而净化废物,有助于碳封存和减缓气候变化。以色列海植物纤维原料生产乙醇主要工序为:预处理、水解糖洋生物技术公司的科学家研发出一种利用海藻制造生物化和发酵。而又以预处理和水解糖化最重要,它直接影响燃料的新方法。他们将发电厂产生的二氧化碳输入海藻乙醇的产率。预处理的目的主要是除去木质素和半纤维池不仅净化了环境,也为海藻提供了充足的营养。研究素,降低纤维素的结品度以及提高基质的孔隙率。预处理显示,每单位面积海藻产生的生物质能要比传统的生物方法主要有物理法、化学法(湿氧化法、稀酸法等)和生物燃料作物高得多,且不含毒素,可生物降解。美国国际法。常见的水解糖化方法主要是酸水解。酸水解可以直接能源公司于2007年11月初宣布启动“海藻变油"研发计将纤维素水解产生单糖,也可以作为酶水解的预处理方划,将从完全基于海藻的光合产物生产生物质燃料国际法。从现有的技术水平看,采用温和的酶水解技术更具前能源公司利用专有的微海藻,自然地使CO2和水光合成景。酶水解法转化纤维类物质成为乙醇的过程通常包括为液态烃类并且按可再生的当量石油计,油量积聚可高4步生物催化的反应:纤维素酶生产、纤维素水解、已糖达其生物质的30%因此,海藻很可能成为今后最有发发酵和戊糖发酵。根据这些生物反应被组合的程度工艺展前途的生物质燃料之一。但是,到目前为止大规模使用过程变化很大。海藻生产燃料乙醇的试验很少。2.1统合生物工艺(CBP)13盾叶薯蓣统合生物工艺(CBP)以前被称为直接微生物转化盾叶薯蓣是薯蓣科,薯蓣属多年生缠绕草本植物,是DMOL艺圓,可将纤维素酶生产、水解和发酵组合在我国提取甾体激素类药物原料薯蓣皂甙元的主要植物。步里完成。自然界中的某些微生物如 Clostridium甾体激素类药物是仅次于抗生素的第二大类药物,随着 Monilia、 Fusarium、 Neurospora等都具有直接把生物质转其不断开发应用,盾叶薯蓣被广泛研究和种植。盾叶薯蓣化为乙醉的能力,研究最多的是用热纤校菌它是嗜热产除含有11%~16.15%的薯蓣皂甙元外,还含有45%芽孢中国煤化工并能使纤维二糖、葡50%的淀粉和40%-53%的纤维素及其他有利用价值萄冂 CNMHG素直接转化为乙的的成分,以其中的淀粉和纤维素为原料发酵生产乙醇既闲秤有很高的经济效益,又具有很好的环境效应。楚德强咧等2.L.1LCBP所需菌株的选育酿酒科技200年第3期(总第177期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2009No.3oll可以通过代谢工程途径进行:①使用能降解纤维素解纤维素能力强的中温和高温型菌株51株经拮抗作用的微生物,如热纤梭菌作为出发菌株,进行末端产物(乙试验选择相互不拮抗的菌株混合后接种最终筛选出了醇代谢途径的代谢工程选育;②使用发酵产物的得率和批分解纤维素能力强的菌种和7个混合菌组合,可供耐性都已经过考验的成熟菌株。 Ingram等将欧文氏菌纤维素降解研究和垃圾、秸秆、畜禽便处理等参考。夏子( Erwinia)的2种内切葡聚糖酶的基因克隆到能生产乙醇芳等网以已实现在E,col中表达的重组质粒pEac-PA的克雷伯氏菌( Klebsiella)中,使该菌配合真菌纤维素酶为基础,构建了pHY-PA、pBBR-PA系列质粒。在此基础发酵纤维素生产乙醇,产率增加了22%。但微生物直接上构建乳杆菌重组菌探索重组乳杆菌的乙醇合成能力。产生乙醇也存在以下问题:碳水化合物发酵不完全,乙用酶糖化生物质原料生产乙醇,其主要的制约因素酸、乳酸、氢的形成导致乙醇产率低;纤维素发酵速度慢,是纤维素酶的成本。可通过多种途径来降低纤维素酶的容积生产力低;终产物乙醇和有机酸对细胞有相当大的生产成本以及提高其利用效率包括使用廉价的木质素毒性2发酵底物,使用有效的发酵方式。柴梅等四对固定化酶2.1.2高效纤维素降解菌的筛选及纤维素酶的应用些理化性质的研究结果表明,固定化纤维素酶的pH溶目前,人工接种纤维素降解菌已从接种单一菌种向解范围与纤维素酶水解反应的最适pH值相符,其低pH接种混合菌种发展。纤维素的混合菌发酵是自然界纤维值稳定性和热稳定性较好。因此为提高纤维素酶的利用素分解转化的人工模拟。混合菌直接发酵能解决酒精产率、降低生产成本提供了一种很好的方法。我国在燃料乙率不高和有机酸等副产物的存在问题。已研究过的能在醇生物转化过程的研究也取得了好的成果。中国科学院共培养体系中增加乙醇产量的微生物有嗜热厌氧杆菌、过程工程研究所陈洪章研究员项目组的专利实现了乙醇嗜热硫化氢梭菌、嗜热解糖梭菌等。 Hogsett等利用嗜热制备过程的纤维素酶解糖化-发酵-液体乙醇分离三重解糖梭菌和热纤梭菌直接转化纤维质为乙醇方面作了研耦合技术,便于协调糖化发酵的最佳作用温度,调节反究,能提高乙醇产量应器内的乙醇浓度、避免高浓度乙醇对酵母菌的抑制以秸秆为原料进行燃料酒精的生产,在目前许多关同时可以保持较低的葡萄糖浓度降低产物中糖对纤维键科学问题尚未完全解决,其中如何针对秸秆组成特素酶的反馈抑制作用,可制得体积分数为40%~60%点,实现秸秆纤维素高效糖化以及消除在后续工艺中原的乙醇。河南农业大学利用秸秆类原料生产燃料乙醇料和产物间的相互抑制是两个极为重要的关键问题。冯的发酵方法专利,采用纤维素酶和木聚糖酶在45玉杰等叫筛选出了1株产酶稳定的纤维素分解菌。采用pH45、150mmin液固比为15的条件下对秸秆进行双酶纤维素分解菌和酵母菌混合菌种发酵工艺,进行秸秆燃糖化燃料乙醇产率达到167%。2006年8月山东泽生料酒精试验研究,有效消除了纤维素分解菌的产物反馈生物公司利用中国科学院过程工程研究所的专利技术抑制及高糖分对酵母发酵的抑制作用,发酵后酒精产量建设了国内首条年产3000t秸秆酶解发酵燃料乙醇示范为16g酒精/00g秸秆。赵小蓉等试验研究,发现6株工程,在利用秸秆生产乙醇的同时,还生产高附加值的低菌中产黄纤维单胞菌和康氏木霉分解纤维素类物质的能聚木糖既克服了木糖转化为乙醇的难题,又提高了经济力比较强,真菌与细菌一起接种时,分解纤维素类物质效益。这些技术具有我国独立的自主知识产权取得了完的速度明显高于其中任何一个单一菌株,说明纤维素类整的技术工艺参数,为秸秆酶发酵万吨级乙醇工业化生物质的分解需要多种微生物的联合作用。高建民等切从产积累了经验四。纤维素乙醇领域的十几个中国专利的含有大量纤维素物质的堆肥里分离到一株土曲霉Ater.内容都集中在糖化发酵环节的开发没有预处理、酶和发reus m,其最适生长温度为45℃最适生长酸碱度为酵菌等的专利在实现纤维素乙醇产业化生产时需要引pH2.0,在最适条件下培养该菌的最高 CMCase活性可进由国外专利控制的酶和发酵菌等技术,因此,我们需要达3680U/mL,并且此酶具有较高的热稳定性和pH稳开发具有我国自主知识产权的酶和发酵菌株,从而增强定性。因具有嗜热嗜酸和高产纤维素酶的特性,在城市垃了燃料乙醇的市场竞争力。圾尤其是酸性环境下的垃圾处理中具有很大的应用价2.2糖化发酵二段法(SHF)与同步糖化发酵法(SSF)值。刘长莉等对一组具有分解纤维素和农药林丹双重间接法即糖化、发酵二段发酵法(SHF),它是用纤维功能的复合菌系NSC-7的培养特性和稳定性进行了探素酶水解纤维素,收集酶解后的糖液作为酵母发酵的碳讨,研究结果发现,NSC-7在5d和14d分别分解稻秆源前研最名的一种方法。为了克服乙醇产物的的447%和73.6%重量,且具有相当高的热稳定性,对抑中国煤化工移出,采取的方法有:温度的适应范围很广,因此该菌株可以用于同步糖化发减压CNMHG-拉伐公司的Bo-sile酵的工艺过程中,可以克服糖化和发酵温度不一致的缺法。对细胞进行循环利用,可以克服细胞浓度低的问题。点。杨声莲等从富集纤维素分解菌的材料中筛选出分筛选在高糖浓度下存活并能利用高糖的微生物突变株,景春城,赵旭,常思静林责,纤维素酶在燃料乙醇工业中的应用研究进展以及使菌体分阶段逐步适应高基质浓度,可以克服基质胞混合糖发酵24h后的乙醇浓度为4.3gL,乙醇产率抑制。为046gg糖。连续发酵过程中木糖的最大转化率为为了克服反馈抑制作用, Gauss等提出了在同一个91.5%。宋向阳等以树干毕赤酵母为发酵菌株,利用海反应罐中进行纤维素糖化和乙醇发酵的同步糖化发酵藻酸锰凝胶代替海藻酸钙,固定化酵母使用寿命明显增法。其特点是纤维素酶对纤维素的水解和酵母发酵生成加。海藻酸锰凝胶耐磷酸盐能力是海藻酸钙凝胶的3倍乙醇在同一容器内连续进行,这样纤维素酶水解的产总糖利用率为958%,乙醇得率为理论得率的923%,发物—葡萄糖由于酵母的发酵不断地被利用,消除了葡酵稳定时间明显长于海藻酸钙固定化酵母细胞乙醇发酵萄糖浓度过高对纤维素酶的反馈抑制,这是目前最有前的稳定时间。季更生等采用以150g木糖和300g/L途的方法。在工业生产上,该法简化了设备,降低了能源葡萄糖混合物模拟植物纤维原料水解液作为发酵底物进的消耗,节约了总生产时间提高了生产效率但存在一行发酵,结果表明,当底物流加速度约为60mLh时,二些如糖化和发酵温度不协调等抑制因素。在纤维素酶的级连续发酵液中酒精平均质量浓度为13.79gL,还原糖糖化过程中纤维素酶的最适温度为50℃左右,而酵母利用率为8309%;当底物流加速度约为45mLh时,发发酵的控制温度是37~40℃,解决这2个过程温度不协酵液酒精质量浓度平均值为1541gL,还原糖利用率为调的方法有:采用耐热酵母(如假丝酵母、克劳森氏酵90.38%;当采用固定化技术和低pH值处理技术后,该系母);进一步选育耐热酵母;耐热酵母与普通酵母混合发统在连续发酵35d的运行中从未发现“染菌”现象,发酵酵等。 Wu Zhangwen采取了非等温同时糖化发酵法,很操作相当稳定。 Yuya Yamashita等甽使用 Zymomonas好地解决了纤维素酶这一矛盾。mobilis Nbrcl3756对纸污泥生物转化为乙醇的效率做在同步糖化发酵中,尽管高浓度的水不溶性固体使了研究。研究结果表明, Z mobilis海藻酸钙固定化细胞,酶和酵母受到抑制,以及预处理材料粘度造成大量运输在分批发酵的作用方式下,从造纸废渣中生产乙醇取得问题。然而,在同步糖化发酵中,水不溶性固体浓度越了良好的效果。总之,虽然固定化细胞发酵在生产燃料乙高,在随后的蒸馏和蒸发过程中所需要的能量越少。M.醇方面的应用技术还不够成熟,但是,其潜在的应用价值Linde等为了降低成本,采用蒸汽爆破和浓硫酸预处将为生产生物乙醇过程“节能减材”。理后的大麦秸秆进行同步糖化发酵,目的是提高水不溶3结语性固体浓度降低酶的使用量和酵母浓度。E. Tomas-Pei6等例探讨了商业纤维素酶( Celluclast1.5LFG)对随着世界人口及经济的增长,能源危机在不断加剧。Kluyveromyces marxianus CECT10875生长的影响,以国际能源署(EA)的最新数据表明中国和印度未来十年及在SF过程中对乙醇产量的影响。 Guido zacchi等的基本石油需求将随着人口及经济的增长翻一番。欧美以预处理后的玉米秸秆水解物作为底物,对SF和SHF各国也在加快生物燃料技术开发的步伐。纤维素乙醇发生成乙醇产量作了比较。结果显示,SSF产生的量将高于酵领域的十几个中国专利的内容都集中在糖化发酵环节SHF3%(理论上SSF为724%,SHF为591%)预处理的开发方面,没有预处理酶和发酵菌种等方面的专利后的匀浆中抑制物对SHF和SSF的抑制程度不同。S.因此在实现纤维素乙醇产业化生产时,需要引进由国外Marques等使用回收的废纸污泥转化生产乙醇,以酶专利控制的酶和发酵菌等技术。因此,应该开发具有我国转化污泥后的主要成分(纤维素和木聚糖)作为底物,采独立的自主知识产权的技术,从而促进我国燃料乙醇工用Ss和SHF2种方式生产乙醇。使用的水解酶是由业的快速发展。虽然我国在基于以上两个方面的研究仍novozym188提供的糖化效率达到了100%。SHF转化落后于世界但是我国在纤维素酶产生菌的菌种选育及率略高于SSF,对应的乙醇产量为196gL纤维素发酵生产乙醇的生产工艺方面的研究取得了可喜2.3固定化细胞发酵的成果,这将为进一步发展我国乙醇能源提供科学支撑。定化细胞发酵具有能使发酵罐内细胞浓度提高,参考文献:细胞可连续使用,使最终发酵液酒精浓度得以提高等特]尤荐燃料乙醇的代谢工程研究进展门微生物学通报20点,常用的载体有海藻酸钠、卡拉胶、多孔玻璃等,目前,32(3):113-l16固定化细胞的新动向之一是混合固定细胞发酵。 Isabella(2】徐锭明甜高粱制燃料乙醇前景广阔门]产业观察,200(2)即图在要规模的中给的x*发中国煤化工和利用口石油规划设计,究了固定化重组运动发酵单胞菌CP4(Pb5)的玉米秸y酵试验,乙醇产率达到0396g乙醇/g糖。 Mahesh等國研CNMHG儿門北日爬甜高粱产业前景广阔中国农业信息,2007,(5):6-7秆水解液的批式和连续乙醇发酵特性。批式固定化细]王莹张峰龙,贾茹珍甜高粱茎汁酒精发酵研究与应用进展101酿酒科技2009年第3期(总第177期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGYNo. 3(Tol. 177)可再生能源,2007,25(1):51-55[21]段黎萍纤维素乙醇的专利综述与分析门现代化工,2008[6]夏爽案焦国际迫捧的中国甜高粱N]科学时报,200809-08(B02)2】柴梅,袁振宏颜涌捷肠溶衣聚合物固定化纤维素酶性质的[7]·汪元欣(责编)以色列高效利用海藻门]农村实用技术,2008,研究]微生物学通报2007,34(3)(01):28[23]MLinde, M Galbe, G Zacchi Simultaneous saccharification[8]丰洋.美国国际能源公司启动海藻变油“研发计划[石油炼and feron of steam-pretreated barley straw at low制与化T,2008,(03):57enzyme loadings and low yeast concentration[]. 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