乙烯信号的接受与转导

植物生理学通讯第39卷 第5期，2003年10月547乙烯信号的接受与转导杨迎伍1.2李正国1.2.”张利陈国平2(西南农业大学 食品科学学院.重庆400716;6 3重庆大学基因工程研究中心，重庆400030)Reception and Transduction of Ethylene SignalYANG Ying Wult, LI Zheng Guol.2.* , ZHANG Li' , CHEN Guo Ping2 (' College of Food Science, Southwest Agricultur-al University, Chongqing 400716; "Gene Engineering Research Center, Chongqing University, Chongqing 400030)提要对乙烯信号转导途径的相关组分.乙烯信号的转导途径以及乙烯信号感知和转导的可能机制研究的最新进展进行了简要介绍,并对今后这一领域的研究方向和在农业上的应用前景进行了探讨。关键词乙烯; 受体;信号转导乙烯是五大类植物激素之一,作为-种内源性相关的突变体。而且在拟南芥(Arabidopsis thali-调节因子在植物生长发育过程中起着重要作用1。ana)中,由于“三重反应”法具有很好的重现性、易乙烯对植物的生长和发育过程的影响包括:种子萌于筛选大量的个体(> 10*),以及在生长的早期阶发、对茎和根伸长的抑制、开花、花和叶的衰老和脱段(3 d)就可进行筛选等优点,所以，“三重反应”法落、性别分化、果实成熟等1.2]。此外,乙烯还参与为乙烯反应突变株的分离提供了一种简单易行的植物胁迫反应,影响植物偏上性生长等。由于乙烯筛选方法。采用“三重反应”法已筛选出许多乙烯对植物生长发育的重要影响,因而成为植物生理的反应突变体。根据已分离的突变体可分为两类[问:重要研究内容。一类是乙烯不敏感突变体(ethylene insensitive以前,对乙烯的研究主要集中在乙烯的生理效.mutants)，即对外源乙烯不显示出“三重反应”,如应、生物合成途径及其调控上。植物中乙烯可受多乙烯不敏感突变体(ethyleneinsensitive,ein)、抗种刺激而诱导合成,如伤害、病虫侵害、各种胁迫因乙烯突变体(ethylene- resistant, etr). 集约ACC突素、机械伤害、植物激素(如生长素、细胞分裂素.乙变体(ACC-intensive, ain);第二类是组成型乙烯烯)、果实成熟、衰老等1.3]。乙烯的生物合成途径，反应突变体( constitutive ethylene response mu-从Met-→SAM-→+ACC-→C2 H,已经清楚[]。在多种tant, ctr), 即在无外源乙烯存在下能组成型地显植物中,编码1- 氨基环丙烷1羧酸(1-aminocyclo-现“三重反应”，如乙烯过量表达突变体( ethylene-propane-1-carboxylic acid, ACC)合成酶和ACCoverproducer, eto)等。氧化酶的基因已经克隆和鉴定,并通过反义RNA1乙烯信号转导的相关组分技术对两种酶的基因进行了遗传学操作从而为控1.1乙烯受体多年来, 研究者们推测乙烯需与制果实成熟和衰老提供了一种有效的方法。近年受体结合后才能对植物产生生理作用。近年来,通来,分子生物学和分子遗传学的长足发展,加速了过对乙烯受体蛋白的研究,为这-推测提供了许多有力的实验证据。植物乙烯信号转导的研究。在研究乙烯信号转导过程中,广泛应用了“三1.1.1 ETR1基因及其编码的蛋白 在拟南芥中重反应”法和分子克隆技术。“三重反应”是指当黑利用“二重后应”表现刑监定了第一个乙烯不敏感中国煤化工酒暗条件下生长的黄化幼苗暴露于乙烯后,其下胚轴突TYHCNMHG通过定位克隆被分膨胀变短、茎杆偏向水平生长、顶端钩状弯曲加收稿2002-09-04修定2003-01-27剧5。由于乙烯感受抑制剂、乙烯生物合成抑制剂资助重庆市应用基础项目 (合同号:6477)和生物力学与组织工和植物丧失乙烯反应的突变体都能阻碍三重反应程教育部重点实验室访问学者基金项目。的发生,质帝敬堡定、分离出乙烯合成及信号转导通讯作者( E mail: zhengguoli@ yahoo. com, Td :023 65 120483)。548植物生理学通讯第39卷 第5期，2003年10月离[6。表达ETR1蛋白的转基因酵母可与乙烯结与ETR1一样都是乙烯受体。合,表明ETR1是乙烯受体,在乙烯信号转导途径.Sakai等[103鉴定出ETR2基因,并发现etr2突的初期起作用”。变体与etr1和ers突变体相似,表现出显性的乙烯ETR1编码的蛋白为一跨膜蛋白，N-端位于不敏感表型。经双重突变型的上位性分析证明，细胞质膜的外侧,C端结构域定位在膜的细胞质一ETR2在乙烯信号转导途径中作用于CTR1的上侧C0]。其中,N-端含有一个包含3个跨膜节段的疏游,ETR2基因位于第3条染色体上。无论在序列水结构,是结合乙烯的活性区域;C端含有组氨酸上,还是在突变体表型上ETR2和ERS都很相似，激酶区域和接收区域。与细菌的双组分调节器因而推测ETR2与ETR1和ERS具有类似的功(two-component regulators)有高 度同源性问]。细能。因此，在拟南芥中,ETR2可能编码第3个乙菌的双组分调节器包括传感蛋白和反应调节器。烯受体。然而,迄今仅获得了一个ETR2的显性等传感蛋白定位在细胞膜上,由一个输入端和一个组位基因,ETR2结合乙烯的能力尚未被确定。因氨酸蛋白激酶结构域构成;反应调节器由一个接收此,还不能确认ETR2 -定编码一种乙烯受体蛋结构域和一个输出结构域构成。在传感蛋白上,通.白。过输入结构域感受信号,激活或抑制组氨酸激酶活根据结构的相似性,乙烯受体基因家族可分为性。激活的组氨酸激酶上的一个组氨酸残基会发两个亚家族(subfamily),即ETR1亚家族和ETR2生自动磷酸化作用,然后磷酰基团转移到反应调节亚家族11。ETR1亚家族包括ETR1和ERS1,编器中接收结构域的一- 个天冬氨酸残基上,从而调节码的蛋白含-个保守的组氨酸激酶结构域和在N-反应调节器中的输出结构域的活性。在细菌中,输端有3个疏水亚结构域。ETR2 亚家族包括入结构域通常有一个DNA结合基元,并直接调控ETR2、EIN4和ERS2,编码的蛋白N-端含有一个转录过程。通过模拟细菌双组分调节器的研究表附加的疏水突出端,且组氨酸激酶结构域缺乏一个明,ETR1通过N端感受乙烯,并把结合信号传递或几个催化活性所必需的元件。到组氨酸蛋白激酶区域和接受器区域。另外,在番茄中也分离得到6个ETR1的同源现在已知拟南芥ETR1蛋白有738个氨基酸基因[12]。Wilkinson 等[13] 发现番茄Nr ( Never-残基,相对分子量为82.5 kD8]。另外,ETR1 蛋白ripe )突变体基因编码一个与ETR1高度相似的蛋在酵母中的表达研究发现,ETR1蛋白是与膜结合白,并从中克隆出Nr基因。Nr蛋白与ERS相似，的(这与推断结果一致)、通过二硫键连接的二聚也缺乏一个接受器结构域。Tieman 和Kleel4]在体。而二硫键是通过ETR1蛋白中位于细胞外区.番茄中还分离鉴定到ETR1同源基因LeETR1、域的前4个氨基酸残基中的半胱氨酸相连接的叮。LeETR2、LeETR4、LeETR5。LeETR1、 LeETR21.1.2 ETR1基因的同源物 在拟南芥中, ETR1和Nr相当于拟南芥的ETR1亚家族，而代表一个小的基因家族。目前已发现与ETR1同LeETR4、LeETR5则相当于拟南芥的ETR2亚家源的基因有: ERS1. ERS2、ETR2和EIN4[8~10]。族。将拟南芥ETR1基因转入番茄中进行异源表目前认为EIN4和ETR1在乙烯信号转导途径中达,发现果实成熟和花的衰老都显著延迟,这表明是最早起作用的。植物对乙烯识别和反应路径有高度的保守性[15]。ERS(ethylene response sensor) 基因是在拟南1.2 其它组分 除了编码乙烯受体的几个基因芥与etr1的交叉杂交中发现的。ERS 基因已经克外,还发现乙烯信号转导途径中的其它几个组分，隆,它位于第2条染色体上,与λAT429标记相如(中国煤化工、ERF和ERN1等。邻[8]。据推测,ERS编码第2个乙烯受体蛋白,但1.2YHCNMHG,Kieber等16通过插此受体缺乏反应调节器结构域(此结构存在于入突变在拟南芥中克隆了CTR1基因,并对其结构ETR1蛋白中)。上位性分析表明,ERS1作用于进行了研究。该基因编码的蛋白由821个氨基酸CTR1(信号转导途径中的另一组分)的上游,这与残基组成,相对分子量为90 kD。推断的氨基酸序在etr1突变体本现察到的结果一致。因此ERS1 .列显示,C-端具明显的类似于哺乳动物和果蝇中.植物生理学通讯第39卷 第5期，2003年10月549Raf蛋白激酶家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(ser-于N-端),且N-端和C-端都位于膜的同侧。可见，ine/ threonine protein kinase)的特征,含有所有已EIN2蛋白是一种膜内在蛋白。对EIN2蛋白的序知的蛋白激酶所共有的11个亚域,两者的氨基酸列分析还发现,EIN2蛋白与Nramp蛋白家族在序序列同源性达41%。通过杆状病毒载体把CTR1列上有相似性,但这种相似性仅局限在N-端，C-端.基因导入昆虫细胞中表达的实验表明,CTR1蛋白则无同源性。Nramp蛋白是存在于真核细胞中的具备丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。在动物体中，-种蛋白,它是 作为二价阳离子的转运蛋白。与Raf蛋白是分裂原激活的蛋白激酶激酶激酶Nramp的相似性暗示着EIN2可能作为一种金属(MAPKKK)。不同的Raf蛋白均含有3个高度保转运蛋白在乙烯信号反应中起作用。但异源转化守的区域(CR1~3)。CR1由Raf 蛋白结合位点和实验中，并没有发现EIN2具有转运金属的能富含Cys的锌指(zincfinger)结构组成;CR2的氨力[18。现已证实,在乙烯信号转导途径中, EIN2基酸残基中，丝氨酸和苏氨酸占了极大比例;CR3作用于CTR1的下游,EIN3的上游。位于Raf蛋白的C端,是激酶的催化区域。CTR1EIN3突变虽然会使植株对乙烯的敏感性减的C-端与CR3区域高度同源,但CTR1缺乏CR2弱,但并不完全失去对乙烯的敏感性,这可能是由区域中的锌指结构和结合位点[16]。于EIN3代表一个具有丰余功能的小基因家族。对所有的ctrl突变体(包括激酶中最保守的残Chao等[19]研究表明,EIN3编码一种核蛋白,在乙基上单个氨基酸的突变)分析表明,CTR1的激酶烯信号转导中作为核调节因子起作用。EIN6 和活性在乙烯反应途径中是必需的,充当负调节物的EIN7在乙烯信号转导途径中起作用的确切部位还作用[16]。不清楚。CTR1的N-端具体功能还不清楚1。在N-Tieman等[30]在番茄中分离了EIN3的同源端结构上,CTR1与Raf仅有非常有限的同源性，基因LeEIL(LeEIL1、LeEIL2、LeEIL3)。降低单CTR1的N-端不含有哺乳动物细胞中Raf蛋白上- 的LeEIL基因表达的转基因番茄在乙烯反应上的保守锌指。CTR1的N-端含有一个共有的P-没有大的变化,但抑制多个LeEIL基因的表达则loop序列,此P-loop序列是一个核苷酸结合折叠对乙烯的敏感性会大大降低。降低LeEIL的表达结构。但P-loop序列是否就代表CTR1的功能结会诱导枝叶偏上性、花脱落、花衰老以及果实早熟构域,还有待进-步研究1。等。说明LeEIL基因为功能丰余基因，在多重乙CTR1蛋白是乙烯信号转导的中心组分,它作烯反应中作为正调节因子调节植物生长发育。我用于乙烯受体蛋白的下游，是EIN2、EIN3、EIN5们在番茄中通过EIN3 -GFP ( green fluorescent的负调节因子[16]。protein)标记发现它定位于细胞核中。超表达1.2.2EIN组分ein突变体是对乙烯不敏感的EIN3可以使Nr突变体具有正常的乙烯反应,果突变,在乙烯条件下没有“三重反应”。现已发现的实正常成熟(未发表资料)。说明EIN3的超表达EIN突变体有ein2、ein3、ein4、ein5、ein6、ein7等6可以恢复突变体的成熟性能。种[呵]。其中EIN4编码一种乙烯受体蛋白。1.2.3 ERFs ERFs ( ethylene-responsive fac-ein2是一种强的乙烯不敏感隐性突变体,导致tors)是-类乙烯反应转录因子，它们作用于EIN3植株对乙烯完全不敏感。ein2 突变株可防御由一下游,可以与乙烯调 节表达基因的启动子区的系列病原菌所引起的感染,说明它在乙烯敏感性和GCC( AGCCGCC)框结合,从而引起乙烯反应418]。抗病性中发挥作用。Alonso 等[17用定位克隆法已对语中国煤化工列和功能研究表明,它分离出EIN2基因。EIN2编码一个分子量为141们可MYHCNMHG型都具有极为保守的kD的二态结构的、含1294个氨基酸残基的多肽。DNA结合区域,但其酸性调节区域的位置具有很含461个氨基酸残基的N-端是极端疏水性区域,大差异,从而影响其调节性能。当酸性调节区位于而含833个氨基酸残基的C端则主要是亲水性基5’-端时(Class I ),活化乙烯反应;当酸性调节区团。推断万市数握白含12个跨膜螺旋区域(都位位于3'-端时(Class I ),抑制乙烯反应;但当5’端植物生理学通讯第39卷 第5期，2003年10月和3’-端同时具有酸性调节区时(Class I),能更强跨膜区,且亲水性较强。ERN1的N-端含有一个地活化乙烯反应。据我们在番茄上的研究结果显多脯氨酸区段和一段相邻的甘氨酸残基链(其重复示，在果实成熟前,活化子表达较低,抑制子表达较单元为GGX,X为任一残基)。其C端含有两个多强;当果实成熟时,活化子表达增强,抑制子表达迅谷氨酸残基的酸性区域和-个富含赖氨酸的碱性速降低;当植物体乙烯信号减弱时,活化子的表达区域。另外,还推断ERN1含有数个磷酸化位点，减弱,而抑制子的表达增强(未发表资料)。这说明磷酸化可以调节ERN1蛋白的活性。这说明它们的表达受到不同环境因子和乙烯水平的调节。ERN1 可能编码一种核蛋白21]。1.2.4 ERN1蛋白Trentmann等[21]采用mR-此外，研究ERN1在乙烯信号转导突变体NA差异显示法,研究拟南芥黄化幼苗乙烯反应途ein3和ctrl中表达的结果证明, ERN1在乙烯信号径中的转录调节问题时发现-种新的乙烯调节的转导途径中的表达水平受CTR1和EIN3基因调核定位蛋白,命名为ERN1(ethylene regulated nu-节,说明ERN1作用于EIN3的下游。clear localized protein)。ERN1 是经RNA印迹分2乙烯信号转导析证明的4个差异表达基因中的一个。在野生型2.1 乙烯信号转导途径 即使有些基因没有从分拟南芥中,ERN1的表达受乙烯的抑制，但在乙烯子水平上得到鉴定,但通过生物化学或突变体间的不敏感型突变体etrl中,乙烯对ERN1的表达无上位性关系分析也可以提供基因产物相互作用顺抑制作用。序的信息。研究者们采用上位分析法已构建了乙ERN1克隆无内含子，编码的蛋白含有407个烯信号转导途径中基因作用的构架模型(图氨基酸残基,理论分子量为45.9 kD,没有明显的1 )[5.11.23]。乙烯反应.ETRIERNI生长.ERSI就芒C2H4”-ERS2-★CTRH-★EIN2-十EIN3 :胁迫ETR2ERFsEIN4脱落成熟图1乙烯信号转导途径的线性关系[由图1可知,ETR1基因产物是在乙烯信号转完全清楚乙烯是如何与受体结合的,乙烯受体又是导途径中最早起作用的。ERS1. ERS2、ETR2、如何把信号传递给下游组分的。但通过近年来的EIN4是ETR1的同系物，也编码乙烯受体蛋白。研究.研究者们提出了一些假设。乙烯信号需与受体蛋白结合后,才能通过CTR12.2.1乙烯与受体结合的可 能机制乙烯 与受体向下传递.最后产生乙烯反应。CTR1是信号转导的结合可能发生于质膜上。ETR1及其同系物可途径中的中心组分。另外,ctr1和etr1、ein3、ein4能是金属蛋白(如含Cu2+ ),乙烯与受体之间是通突变体间的上位性是完全的,且在etr2、ein2和过与蛋白结合的转运金属而相互作用,且受体蛋白ein3间的双重突变体的表型上没有显示任何活性,很可能是形成同型或异型二聚体与乙烯结合[23]。这与推断的乙烯信号线型转导途径是- -致的[6]。早在1967年,Burg等[243 就提出，受体与乙烯最近，Whitelaw等122] 发现,在转反义LeETR1的结合受一种转运金属辅助因子调节。后来发现的番茄中,从第1代、第2代和第3代种子所得的在酵母的提取液中恢复ETR1结合乙烯的活性需所有幼苗对乙烯均呈现正常的“三重反应”。有中国煤化TE明上述假说成立。当LeETR2转录物在第2代中有轻微的减少,而MYHCNMH G离子在乙烯信号转导LeETR3(NR)转录水平不受影响。由此，中的角色被进一步确定下来。用反义技术抑制Whitelaw等认为乙烯信号是通过平行途径转导RAN1基因的表达将导致组成型的乙烯反应,这的。这与拟南芥中推测的途径是-致的。与受体功能损失所引起的结果一致。RAN1与酵2.2乙 烯信粤慧知和转导的可能机制迄 今尚不母中的CCC2基因有同源性。CCC2蛋白是一种植物生理学通讯第39 卷第5期，2003年10月551定位在酵母细胞后高尔基体泡囊上的铜离子转运因子,信号由受体向CTR1传递是通过受体的组蛋白,它将铜离子转运到酵母的膜蛋白上。此发现氨酸传递结构域与CTR1的调节结构域的相互作表明,植物与酵母一样同样也存在着铜离子转运系用实现的。在无乙烯的条件下,受体/CTR1复合统[1]。乙烯结合区域的结构模型可能是由与一个体负调节乙烯反应。因此,乙烯与受体结合后会降铜离子相互结合的跨膜螺旋结构组成的富含电子低ETR1/CTR1复合体的活性,并导致对反应途的疏水袋，其中铜离子直接与乙烯相互作用。径抑制的去除56.11。而信号在CTR1和EIN3之Bleeker和KendeII认为,受体与乙烯的结合是铜间的转导需EIN2的参与,但EIN2是通过影响金离子的配位化学键改变后,在结合部位引起的构象属的稳态而间接地作用于乙烯信号,还是作为一种变化能转导到ETR1二聚体的传递结构域上的结功能因子直接作用于乙烯信号,还有待进一步研果。后来一系列转运金属的实验证实,只有银离子究。Bleecker和Kendel1I指出,EIN2的C-端可能与铜离子有类似的效应,这与这两种离子的结构相是将乙烯信号向下游组分传递的功能区域,但似性相吻合。因此，在受体上银离子可代替铜离子:EIN2从受体/CTR1复合体接受信号的机制还不与乙烯结合,但银离子不能将乙烯信号转导到下游清楚。EIN3和相关的EIL1和EIL2引起反应途径组成型激活,从而出现乙烯的生理反应。2.2.2乙烯信号转导的可 能机制在研究乙烯信此外,Ca2+也是乙烯信号传递所必需的32.33]。号向下游组分转导的过程中发现,拟南芥的乙烯信这有两方面的证据,一是Ca2+信使系统的阻断剂号转导途径与酵母渗透信号转导途径颇为相抑制了乙烯诱导的特征性反应,如种子萌发、黄化似5.8.27]。酵母渗透转导途径也具有相当于细菌双幼苗的“三重反应”等;二是依赖Ca2+的蛋白质激组分信号转导系统的元件以及类似于激酶级联反酶和蛋白质磷酸酯酶也参与乙烯反应。但对其作应的元件。ETR1蛋白和SLN1蛋白分别在乙烯用机制尚不明了。反应和渗透胁迫反应的早期起作用。SLN1蛋白3展望与ETR1相似，也是信号转导的组氨酸激酶。另随着分子生物学和分子遗传学在植物上的应外,SLN1和ETR1突变分别为编码MAP级联激用,已经克隆和鉴定出了许多乙烯信号转导途径中酶成员的下游基因的丧失功能性突变所抑制,此下的相关基因(如ETR1、CTR1、EIN2、EIN3等),游基因在乙烯信号转导途径中为CTR1(类似于并已基本建立了植物体内乙烯信号转导途径的框MAPKKK),在酵母的渗透反应途径中为PBS2架。以后的研究重点可能在:对这些组分进行更深(类似于MAPKK)和HOG1(类似于MAPK)。在层次的生物化学分析,三维结构与功能的关系及其酵母的渗透反应中,反应调节器SSK1相当于双组对生长发育的调节过程,信号在细胞内的级联放大分中的第二个组分,它的磷酸化状态受SLN1蛋白和跨入核膜激活靶标基因的过程,乙烯与其它植物的活性所调节。SSK1 随后调节SSK2和SSK22，激素的相互作用方式，从而明确乙烯在植物生长发后两者都是蛋白激酶，它们的氨基酸序列与MAP-育中的作用机理。KKK非常相似。SSK2 和SSK22磷酸化PBS2 ,后对乙烯信号转导途径的研究,为利用生物技术者又磷酸化HOG1[28]。控制果实成熟、衰老及抗病性研究等具有重要的指根据细菌的信号转导和酵母的渗透反应途径导意义。采用生物工程技术控制果实成熟、衰老主可以推测，植物中乙烯信号的传递是通过蛋白级联要有两种途径。一是通过控制乙烯的合成，这种磷酸化完成的29]。Chang 等[30] 人又提出乙烯的信方汽中国煤化工射贮藏的转基因番茄、号转导是通过蛋白质与蛋白质的相互作用进行的。甜厂YHC NMH G希信号的转导，即降低最近,Novikova等[31] 指出在乙烯信号转导途径果蔬对乙烯的敏感性,从而抑制果实的成熟和衰中,MAP级联激酶的作用还有GTP结合蛋白的老。同时可以通过调节乙烯的信号转导增强果蔬参与。的抗病性。相信今后随着乙烯信号转导途径的逐在乙孺宿麴转导途径中,乙烯受体作为负调节步明确,必将为控制果蔬的成熟和衰老以及增强抗552植物生理学通讯第39卷 第5期，2003年10月病性提供更多可操作的基因位点和控制方法。18 Ohme- Takagi M, Shinshi H. 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