螺旋藻乙醇酸氧化酶(GO)的研究

微生物学通报2005年32(4)螺旋藻乙醇酸氧化酶(GO)的研究王志忠巩东辉刘华乔辰(内蒙古农业大学农学院呼和浩特010019)摘要:采用比色法对鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻(S)与国外引进的钝顶螺旋藻(S2)和极大螺旋藻(S3)的乙醇酸氧化酶(GO)进行了比较研究。结果表明:在25℃pH8.0条件下,S1、S2和S3的CO活性分别为70.9U/gFW、59.6U/gFW和80.9U/gFW最适温度均为30℃;在0℃~35℃(30℃)范围内比较稳定;最适p值分别为86、8.2和8.4;pH值稳定范围,S1为76-10.0、S2为80-9.0;S3为8.0-8.6。S1的CO对温度和pH适应范围最宽,且在低温、高温、强酸和强碱下的活性均比引进种的高。关键词:螺旋藻,乙醇酸氧化酶,酶动力学,鄂尔多斯高原碱湖中图分类号:Q554.9文献标识码:A文章编号:0253-2654(2005)04406804Study on Glycolic Acid Oxidase(GO)of Spirulina(Arthrospira)WANG Zhi-Zhong GONG Dong-Hui LIU Hua QIAO ChenDepartment of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University, Huhehaote 010019)Abstract: A comparative study on the glycolic acid oxidase(Go)of the domestic Spirulina( Arthrospira)plat-ensis(S, )from alkaline lake in Erdos Plateau and the imported S.(A.)platensis(S2)and S.(A)maxima(S,)as well is made with colorimetric method. The results show that activity of Go(25C, pH8. 0)of S,, s2and S, is 70.9 U/gFW, 59.6 U/gFW and 80.9 U/gFW respectively: the GO,'s optimum temperature of $1, S2and S is 30C: the GO,s optimum pH value of $, is 8.6, while that of S8. 2 and that of S3 8. 4: the Go of Sis stable from0℃to35℃ and from pH7.6topH10.0, while that of s.2 from 0℃to30℃ and from pH8.0topH 9.0 and that of S, from 0C to 35C and from pH 8. 0 to pH 8. 6. Adaptive range of $, Go for temperatureand ph is wider, and activity at low and high temperature and under strong acidand alkali conditions is higherKey words: Spirulina(Arthrospira), Glycolic acid oxidase(GO), Enzyme kinetics, Alkaline lake in Erdos乙醇酸氧化酶( Glycolic acid oxidase,简写GO)(EC1.1.3.15)广泛存在于光合生物中,是光呼吸代谢中的关键酶,其活性高低与光呼吸强弱呈正相关。研究证明光呼吸释放的CO2约占C3植物净光合速率所同化CO2的20%~50%,这对植物的生长和干物质积累都有很大的影响。因此,研究乙醇酸氧化酶无论是筛选低光呼吸品种,还是调控光呼吸代谢均具有重要意义。螺旋藻是一类光合放氧的丝状蓝藻,属于C3植物。其富含优质蛋白(60%70%)和多种生物活性物质,是人们广泛接受的功能性食品之一3。目前,有关螺旋藻生长和光合作用等研究较多,但酶的研究相对较少,特别是有关GO的研究未见报国家自然科学基金项目(No.30460104)内蒙古自然科学基金项目(No9903034)通讯作者Tel:047146946216,E-mail:qiao-chen@shu.com收稿日期:2004-10-13,修回日期:2004-12012005年32(4)微生物学通报道。本文以鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻与国外引进种为材料,对其乙醇酸氧化酶进行了比较研究,一则丰富该地区螺旋藻种质资源的基础研究;二则为已初具规模的鄂尔多斯高原螺旋藻产业筛选低光呼吸品种提供理论依据。1材料与方法1.1材料实验材料见表1。表1实验材料一览表样品物种产地(来源)钝顶螺旋藻鄂尔多斯高原巴彦淖尔碱湖Spirulina( Arthrospira) platensis(内蒙古农业大学)钝顶螺旋藻非洲Chad湖S.(A)platensis(南京大学生物科学与技术系)极大螺旋藻墨西哥 Sosa Texcoco湖S.(A)maxima(南京大学生物科学与技术系)注:下文对应样品以此表为准1.2方法121藻的培养:采用 zarrouk培养液在室温自然光照下通气培养。1.2.2粗酶液制备:准确称取处于对数生长期新鲜藻3g,置于预冷研钵中,加人少许pH8.0的磷酸缓冲液及石英砂,在冰浴中研磨成匀浆,离心5min(3,500r/min)取上清液定容至20mL备用123Go活性测定:采用比色法,略有改动。以△0.01Aa/min所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。1.2.4温度对GO影响:在0℃~96℃和pH8.0的0.1mo/L的磷酸缓冲液条件下分别测定酶活性,绘制酶活性-温度曲线;将酶液在上述各温度条件下保温15min,后在25℃下测定酶活性,绘制酶稳定性一温度曲线。每个处理重复3次。1.2.5pH值对GO影响:在pH2.6~12.0范围内分别测定酶活性,pH2.6~7.0用柠檬酸-磷酸缓冲液,pH7.6~9.0用硼酸-硼砂缓冲液,pH10.0~12.0用磷酸氢二钠和NaOH调配成的,绘制酶活性-pH值曲线。将酶液在各相应的pH条件下保温15min,在25℃时测定酶活性,绘制酶稳定性-pH曲线。每个处理重复3次2结果与分析2.1螺旋藻Go活性在25℃、pH8.0时, Sosa Texcoco湖的极大螺旋藻(S3)GO活性(80.9U/gFW)最高,鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻(S1)活性(70.9U/gFW)居中,Chad湖的钝顶螺旋藻(S2)活性(59.6U/gFW)最低,且钝顶螺旋藻(S1、S2)GO活性均低于极大螺旋藻。2.2温度对螺旋藻GO的影响温度对螺旋藻GO活性的影响见图1。螺旋藻GO活性呈钟形曲线,最适温度为微生物学通报2005年32(4)30℃,此时S1、S2和S3的GO活性分别为81.5U/gFW、67.5U/gFW和98.5U/ghW。在0℃和96℃下,鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻S1的CO活性均高于引进种,说明其对低温和高温的忍受能力最强(表2)温度对螺旋藻CO稳定性的影响见图2。鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻S3和SosTexcoco湖的极大螺旋藻S3的GO在0℃~35℃范围内比较稳定,Chad湖的钝顶螺旋藻的GO在0℃~30℃比较稳定,S1和S3的GO热稳定范围比S2宽5℃。在温度稳定性范围内,GO活性高低排列顺序为S3>S1>S2;当温度超过35℃(或30℃)以后,GO稳定性均明显下降,在3个样品中S2的CO稳定性最差。在96℃下,3个样品GO稳定性均下降到最低,但S1比引进种的略好。10008m0已500001001020253035405060708090960102025303540506070809096r/℃图1螺旋藻GO温度曲线图2螺旋藻GO热稳定性曲线表2在极端和最适的温度、pH值下螺旋藻GO活性的比较活性最大活性最大活性最大152/S3(U/gFW)活性%(U/gW)活性%(U/gFW)活性%8.8温度(℃)3064.017.026.610.011.34.05.71.74,32.65.07.12.04.34最适70.91.211.0l1.115.75.49.012.32.1.1注:S1/S2和S1/S3是指酶活性之比2.3pH值对GO活性的影响螺旋藻GO活性随pH值的变化见图3。3个样品GO的最适pH值在8.2~8.6之间,其中S1为8.6,活性为70.9U/gFW;S2为8.2,活性为60.2U/gFW;S3为8.4,活性为80.6U/gFW。当pH≥9.0时,S的GO活性均比引进种的高(表2),说明鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻GO比引进种有较强耐碱性。在pH2.6和pH12.0时,螺旋藻GO活性均很低,甚至有的已失活。螺旋藻GO的pH值稳定性见图4。3个样品的pH值稳定性曲线均呈不等腰梯形稳定范围不尽相同,S1在pH7.6~10.0;S2在pH8.0~9.0;S3在pH8.0~8.6。鄂2005年32(4)微生物学通报尔多斯高原钝顶螺旋藻SGO的pH稳定范围最宽,Chad湖的钝顶螺旋藻S2次之,SosaTexcoco i湖的极大螺旋藻S3最窄。在稳定范围内,GO活性强弱排列为S>S1>S2900800007030c200040001026406.07.6828.610.012.02.64.06.07.68.28.610.012.0图3螺旋藻GO活性pH曲线图4螺旋藻GO活性pH稳定性曲线S1,-0-S2S1,0-S2,▲S33讨论从总体上看,Chad湖的钝顶螺旋藻GO的活性最低,鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻居中, Sosa texcoco湖的极大螺旋藻最高。我们在培养液温度228℃~25.0℃、光强31-233μmo/m3s下,Chad湖的钝顶螺旋藻净光合速率最高,鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻次之, Sosa texcoco湖的极大螺旋藻最低(待发表)。由此看出,螺旋藻GO活性与净光合速率存在负相关。但CO活性对螺旋藻光呼吸、净光合速率及产量的影响程度仍有待于进一步研究。鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻GO对pH值适应范围较引进种的宽;在强碱下的活性也较髙,这与其所处环境有关。鄂尔多斯高原位于世界盐碱湖带上,其盐碱湖面积小,湖表卤水的水位、矿化度和化学成分受地质条件、大气降水、风力和蒸发作用等自然因素的影响6。该地区年降水量为250~360mm;年蒸发量为2470mm~2691mm,蒸发量是降水量的7~11倍;风多风大,年平均风速3.5m/s,最大风速28m/s,扬沙日数40~50d/a,沙暴日数12~16d/a。碱湖多数年份有湖表卤水但当气候连续干旱时,也会出现干涸。所以受当地地质和气候条件的影响,湖水的pH值高且波动比较大。在这样碱湖中生存的螺旋藻经过长期的自然选择,表现出对pH值变化范围宽和高pH环境的适应性。致谢引进的钝顶螺旋藻和极大螺旋藻由曾昭琪教授惠赠,特此致谢。参考文献[1]王炜军,彭新湘,李明启.华南农业大学学报,1999,20(3):117-122[2]孟繁静,刘道宏,苏业瑜.植物生理生化.北京:中国农业出版社,199171[3]汪志平,钱凯先,微生物学通报,200,27(4):288-291[4] Zarrouk C. PhD Thesis University of Paris France, 1966, 74[5]张志良,植物生理学实验指导(第二版).北京:高等教育出版社,1990.126-129[6]郑喜玉,张明刚,董继和,等,内蒙古盐湖.北京:科学出版社,1992.137[7]《伊克昭盟农业区划》编辑委员会,伊克昭盟农业区划.呼和浩特:内蒙古人民出版社,1990.9-105