循环水根系分泌物收集技术的研究及应用

第25卷第6期北京林业大学学报Vol.25, No.62003年11月JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITYNow.. 2003循环水根系分泌物收集技术的研究及应用*贾黎明冯菊芬文学军孙焱(北京林业大学资源与环境学院) (山东 省淄博市國林管理处)摘要该文作者于2000年设计并应用循环水根系分泌物收集装置,结合D061型树脂柱收集了纯裁和混栽条件下杨树与刺槐氨基酸类N索根系分泌物,并对其物质形态进行了初步研究.结果表明:循环水根系分泌物收集装置能够正常运转,真正实现了在现实裁培条件下无损根系,实时、连续、富樂定量、准确收集和研究根系分泌物.仅仅7d时间即可收集到根系分泌物中的多种氨基酸.并达到可检出的量精氨酸和甘氨酸是纯裁刺槐根系分泌物中的主要氨基酸，占游离氨基酸总量的43.2%;而精氨酸和赖氨酸是纯裁杨树以及混裁苗木根系分必物中的主要氨基酸.循环水根系分泌物收集技术为根系分泌物的深入研究提供了方法上的保障.关键词根系分泌物,收集装置,杨树,刺槐,混交林,种间关系中图分类号S718.43Jia Liming; Feng Jufen; Wen Xuejun; Sun Yan. Cycling water collection technique on root exudates andits application. Jourmal of Beijing Forestry University (2003)25(6)6-10 [Ch,9 ref.] School of Resourcesand Environment, Beijing For. Univ., 10083, P. R. China. .Amino acids in nitrogen root exudates of pure and mixed planted black locust and poplar seedlings werecollected and identified by the designed cycling water olleetion device of moot exudates and D061 ion-ex-change rsin in this paper. It shows thal: the ecycling- water cllection device of root exudates could be operatednormally. The certain amounts of root exudates are enriched in the device that makes the materials collectionsccessful without damaging the roots in time and continuously as well. Only by seven days, many kinds ofamino acids in nitrogen root exudates were collected and detected quantitatively. Anginine and glycin were themain kinds of amino acids in root exudates of pure planted black locust seedlings and reached 43.2% in disso-ciative amino acids. Anginine and lysine were the main kinds of amino acids in root exudates of pure plantedpoplar seedlings and mixed planted poplar and black locust seedlings. It is concluded that the ecycling- watercollection technique is much better than other methods to conduct the study on root exudates。Key words root exudates，clletion device, poplar, black locust, mixed forest, interspecific relationship我国对混交群落树种间关系的研究经历了约主导作用的是养分关系,这种关系不仅表现为对土50年,从对树种闻关系现象的简单描述逐步上升到壤的改良,而且也表现为树种间N、P养分的互补转对树种间关系机理的深入研究上，取得了一大批研移,即通过根际微区杨树可以转移磷给刺槐,而刺槐究成果.尤其是进入20世纪90年代,在国家自然科可将固定的氮转移给杨树12-4),这种转移主要通过根学基金的多次重点资助下,对树种间相互作用机制系的相互接触来完成5).本文则欲通过研究两树种的了解越来越深人,在化感作用、以养分关系为主的的根系分泌物组成,进--步探索两树种养分转移的生理生态相互作用机制等多方面都取得了重要突物质形态,从而为揭示树种间养分转移的生态学意破" .这一时期,北京林业大学“混交林及树种间相义奠定基础,并为今后的研究进行方法上的探索.互作用机制”课题组以杨树、刺槐混交林为模式群落对根系分泌物的研究是植物营养、化感作用、根对树种间相互作用机制进行了深人研究.前期研究际微生态研究的重要内容,受到国内外的普遍重视.发现，在杨树刺槐混交林树种间复杂相互关系中起因为植物根分泌物不仅是根-土界面的润湿剂、微2003-04-16 收精htp://ww . wanfangdata. com.cn●国家自然科学基金重点项目(39230280)和国家自然科学基金项目(39870643)共同资助，第一作者:贾繁明,男,1968年生,博士,副教授.主姜研究方向:森林培育、城市林业。电话:010-62338194 E mljim@bjfu.edu.cn地址:100083北京林业大学资源与环境学院.第6期贾絮明等:循环水根系分泌物收类技术的研究及应用生物的能源物质,更重要的是植物营养效率基因型定期喷洒福尔马林溶液灭菌;配制好的Hoagland全差异的标记物及植物间相互作用的纽带.根系分泌背养液高温高压灭菌(温度1219C,压力0.1 MPa条物的收集、分离和鉴定是一个国际性的难题,尤其是件下,灭菌1个b);培养基质处理和灭菌:将粗沙、如何能够收集到足够量不受微生物污染的根系原始鹅卵石、玻璃棉放在稀释浓度为0.1% ~ 0.2%的盐分泌物更为困难.目前,根系分泌物的收集方法主要酸中浸泡一昼夜,第2天用自来水冲洗至pH值为有出土根系淋洗法、营养液培养法、沙培法、琼脂固7,然后将它们高温高压灭菌(条件同上).自然冷却定定位培养收集法等(68] .根系淋洗法不可取，因是后作为栽培基质;将盆栽容器、乳胶管、玻璃器皿浸泡将根系挖出后淋洗,根系已受损伤,收集的根系分泌于稀释浓度为0.15%福尔马林溶液中1昼夜灭菌.物中更多的是根系本身的内含物和伤流液;营养液1.4 收集根系分泌物中氨基酸类N素物质树脂和培养法则使根系基本处于一个厌氧环境，收集的根系分泌物不能代表正常生长状态的情况;如解决了树脂:购自南开大学树脂厂的D061大孔强酸性微生物的影响，沙培法和琼脂固定定位培养法是当苯乙烯系阳离子交换树脂.前效果较好的根系分泌物收集法,因其基本上能代树脂的预处理:树脂从厂家购入时含有杂质,且表植物的自然生长状态.本文通过总结前人的经验,全部为钠型,需将树脂转化为氢型,以便与氨基酸进在借鉴国外研究[9的基础上,设计并应用循环水根行离子交换.处理方案如下:树脂先用去离子水浸泡系分泌物收集装置,配合离子交换树脂,对刺槐1~2d,除去杂质;用2倍于树脂体积的2 mol/L HCI( Robinia pseudoacacia)、群众杨(小美旱)( Populus[ P.常温下不断搅拌30min,然后用去离子水洗至中性,simoni x ( P . pramidalis + Salix matsudana)])根系分再用2倍于树脂体积的2mol/LNaOH常温下搅拌泌物中氨基酸类N素物质进行了实时收集,并进行30 min,然后再用去离子水洗至中性.将上一步骤再了分离鉴定.重复-遍,然后用2 mol/L HCl搅拌30 min, 用去离1试验材料和方 法子水洗至中性,待用.树脂柱的制备:采用湿法装柱.层析柱中先加入1.1 试验设置时间、地点:2000年6月,盆栽试验设在北京林少量去离子水,取适量处理好的树脂用去离子水浸湿后,装入层析柱，注意装柱时勿使柱内有气泡,最业大学苗圃生物中心温室.植物材料:群众杨(小美旱)当年扦插苗,刺槐1后使液面与柱内树脂面相切,使树脂保持湿润.接人支置.年生实生苗.盆栽容器:去底5 L的方形塑料桶(规格15 cm.5 根系分泌物收集缓苗期过后(约20 d),用蒸馏水将系统中残存x I5cmx 32 em),倒置.配置方式:3处理3重复,3处理为纯裁刺槐(每的营养液和根系分泌物喷淋冲洗,直到没有茚三酮盆3株);纯栽杨树(每盆2株);混栽(每盆2株刺槐显色反应为止,目的是去除缓苗期间的根系分泌物.将选择的最佳树脂柱接人循环水根系分泌物收集装1株杨树).栽植:选择根系较发达的1年生刺槐苗(根系有置,采用去离子水循环接柱连续收集7 d后,用洗脱根瘤),根系进行适当修剪后用0.15%的富尔马林液洗脱树脂柱.洗脱分两步进行:第一步用pH=6.6溶液表面灭菌,栽植于容器中;早期在无菌土上扦插的0.38mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液洗脱碱性氦基酸;第二步用pH= 8的0.2 mol/L Na, HPO,一的杨树苗木移人容器.栽培基质:粗沙、鹅卵石、玻璃棉;以Hoagland全0.1mol/L柠檬酸缓冲溶液洗脱中性和酸性氨基酸.营养液为培养液.然后用“旋转蒸发器”对洗脱下来的根系分必物进行1.2 循环水根系分泌物收集装所需材料浓缩.将浓缩后的根系分泌物样品送中国林业科学容器:去底5 L的方形塑料桶(规格15 cmx 15院森林生态环境研究所有机分析室,利用氨基酸自cmx 32 cm),倒置;小型空气压缩机:功率35W;橡动分析仪进行样品分析.皮塞:大小以可塞严容器口为准,且橡皮塞中部打孔2结果与分析塞入玻璃管;乳胶管;直玻璃管若干;“T"型管;“Y"型管;小漏斗;特制带方孔木桌;树脂柱:层析柱,规2.1循环水根 系分泌物收集装置运行格为10mmx200mm.在前人对杨树、刺槐根系分泌物收集研究的基1.3灭菌处理础上”,为了能真正实现在现实栽培条件下无损根培养室为封闭玻璃小温室,内设紫外灯消毒,并系、实时连续、高集、定量、准确收集和研究根系分8北京林业大学学报第25卷泌物,专门设计并制作了“循环水根系分泌物收集装棉,然后铺一层鹅卵石,起到密封的作用，可阻止或置(图1)".减少空气中微生物向循环系统中侵人.(3)空气压缩机进气口连接一小漏斗,小漏斗中塞人经灭菌处理的玻璃棉,防止空气中的灰尘进人机体,延长空气压缩机的工作寿命,同时也阻止或减少空气中的细菌进人循环装置.(4)循环装置中“T型玻璃接口的导气口应调整在回水口的下方,气流才能顺利使下水口流出的循环液回流到栽培容器中;同时气流在“T”型玻璃接口下水口处产生负压，可促使树脂柱中的循环液下流，从而利于整个循环系统循环液的正常流动.(5)回水管要相对较长,利于来回调整回流液回流于栽培容器中的位置(调整回水位置,可使回流液16|在各个方向均匀向下淋洗根系分泌物).(6)循环液(培养液或去离子水)要适时适量注人,注人量太少会影响循环系统的正常循环,注人量12过多,会使苗木根系长时间浸泡处于无氧呼吸状态，可能致使苗木死亡.培养液的无节制加入会出现苗木营养过剩,导致苗木的高生长过度,而影响苗木的1裁培容器; 2盆裁苗木;3幕卵石;4骏璃棉;5粗钞子:6橡皮.径生长,因此培养液可隔一段时间(如:1周)加1塞;7玻璃管;8下水管:9树脂柱: 10树脂: 11砂心; 12止水次,其它时间用灭菌去离子水.钳;13"T"型玻璃接口; 14回水管; 15"Y"型玻璃接口; 16导气管; 17小型空气压编机: 18小豉消漏斗。(7)正式收集前，即循环装置未安装树脂柱之图1循环水根系分泌物收集装置结构前,循环液流速不需控制，只要保证其正常循环即FIGURE 1 The structure of the cyeling water eeleliene derice可.安装树脂柱之后,不但要保证循环液的正常循o roo exudate环,同时需要通过止水钳调节循环液的流速,使其保其工作原理是苗木栽植后,向容器中注人适量持在5 m/min,这样才能使根系分泌物中的N索物培养液,培养液向下渗流的过程中将根系分必物向质与树脂充分进行交换;如果循环液流速过快,交换下淋洗,小型空气压缩机能够长时间不间断工作,其吸附还来不及进行,根系分泌物又被回流到裁培容吹出的气流通过乳胶管(导气管)到达下水口时,在.器中,达不到交换吸附的目的.此产生负压,可使培养液通过乳胶管(导气管和回流(8)正式进行根系分泌物.N素物质的收集时，管)将自栽培容器中下流的培养液回到栽培容器,形为了能使循环液充分淋洗栽培容器各个部位的根系成又一次下渗淋洗,循环回路形成.在培养液下水口分泌物N素物质,我们将回流液蓄积于小喷壶中，接入选择性吸附树脂柱,根系分泌物中的物质会被达一定量时用人工向栽培容器中均匀喷酒.树脂柱不断富集.经过长时间的试验证实这一装置2.2收集根系氨基酸类N案分泌物的影响因素能够正常运转,并能在根系分泌物研究中发挥很好2.2.1 Hoagland 营养液对收集根系氨基酸类N素的作用.分泌物的影响为保证循环装置正常工作,使树脂柱能成功富Hoagland 营养液中含有大量的K' .Na* 、Ca'等集根系分泌物,我们在实践中总结得出-些经验:金属阳离子,这些金属阳离子与树脂的离子交换能(1)培养室、循环装置的各组件均需灭菌处理，力远大于根系分泌物中N素有机物质与树脂的离使循环系统内部尽可能的在无菌条件下运转,以防子交换能力.试验表明,用2 mL营养液过柱后,其中止大量微生物的侵人使根系分泌物中的N素物质的Ca*被树脂100%离子交换;用营养液湿法装柱变性,致使试验收集的并非真正的根系分泌物.比用蒸馏水湿法装柱最大离子交换氨基酸的量减少(2)容器最底层垫一层玻璃棉,玻璃棉 上再铺43% ;用营养液代替蒸馏水配甘氨酸+丙氨酸+赖-层鹅卵石,可阻止粗沙子被循环液淋洗进人玻璃氨酸标准溶液,其最大离子交换量减少74% .试验管、乳胶管,致使循环受阻;其上放入裁培基质中还发现,在采用循环水收集根系氨基酸类N素分粗河沙,将苗木裁培好后,再在粗沙上铺一层玻璃泌物过程中,收集1h后,取过柱前的循环液比色呈第6期贾黎明等;循环水根系分泌物收集技术的研究及应用无色,但过柱后比色却呈微紫或淡紫色.这是因为过外,又在洗脱后的流出液中加10%醋酸铅,生成白柱前循环液中的氨基酸含量较低,且浓度较小，所以色沉淀后将其过滤,此操作重复5~6次,直至不再比色时会呈无色,而循环液过柱后树脂除了离子交产生白色沉淀,证明鞣酸全部除去.换营养液中的金属阳离子外.也能离子交换氨基酸,2.3混栽杨树、剌槐根系N素分泌物分析但由于树脂离子交换金属阳离子的能力优于氨基表1根系分泌物氨基酸含量酸，所以被富集在柱子上的氨基酸又被取代下来,此TABLE I The content ofacids in root exudates时氨基酸的浓度较过柱前高,因而比色时显紫色.可of black locust and poplar seedlings见，Hoagland营养液对根系分泌物中氨基酸类N素纯槐1纯杨/物质的收集有很大影响,从某种程度上讲,营养液具氨基酸(uB°周1 (0g周一) (rx周一)混栽/混裁理论值1有洗脱氨基酸的作用.另外,一旦培养液中的金属阳周-)离子被交换离子交换,循环液将呈酸性,以至苗木根天门冬氨酸0.1170.078苏氨酸0.4620.0110.312系渗透势发生了变化,苗木会表现出受盐胁迫的萎丝氨酸0.5290.0240.361蔫现象(试验开始2个h左右就会有所表现).谷氨酸0.00 :0.002为了排除营养液对收集氨基酸类N素根系分甘氨欣0.9280.0170.624丙氨酸0.3570.0130.242泌物的影响,在正式收集根系分泌物时需将营养液缬氨酸0.1630.112全部推放掉,并用蒸馏水少量多次冲洗至没有无机蛋氨酸离子.前面已经提到，在培养期间为控制苗木营养过异亮氨酸0.0770.029 0.0250.061甚需隔一段时间(7d 左右)加一次营养液,因此在营)亮氨酸0.1650.06t0.069 .0.130酪氨酸0. 194.0.1430.0640.177养液培养-段时间后排空营养液(不要超过7d)对0.11苗木生长没有什么不利影响，在此期间收集氨基酸3组氨酸0.1480,079 0.2170.12514 赖氨酸0.2990.5570.6410.385类根系分泌物为好.15 精氨酸1.0710.3860.9130.8432.2.2收集时间对根系 N素分泌物测定的影响氨基酸总量1.97在预备试验时,利用循环水根系分泌物收集装注:一为痕量;混裁理论值=纯槐x23+纯杨x1/3.置收集分泌物24h,并用两种洗脱液以最小洗脱量分别对各种氨基酸进行洗脱(即先用3 mL pH=6.6前期研究“中“测定了混槐及纯槐根系分泌物的0.38mol/L柠橡酸-柠檬酸三钠缓冲溶液洗脱碱中易被吸收的小分子N素物质,结果表明,刺槐根性氨基酸,再用8mLpH=8的0.2mol/LNarHPO。-系分泌物中以氨基酸态-N为最多,其次为NH: -N,0.1mol/L柠檬酸缓冲溶液洗脱中性、酸性氨基酸)，NO;-N含量较少,而酰氨态-N含量极低”,本研究将洗脱后的11mL流出液合并在一起,用旋转蒸发中应用“二缩脲反应”检验发现,在杨树、刺槐纯裁和仪在50C~ 60下浓缩成5 mL,作为根系N素分泌混裁的条件下苗木的根系分泌物中未检测出有多物待测液送中国林科院分析鉴定.但因一天内其根肽、蛋白质等N素物质,因此首先主要以含量最多系氨基酸类N素分泌量太少,用氨基酸自动分析仪的氨基酸态-N为对象进行杨树、刺槐N素根系分测定时,前面三种氨基酸(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨泌物的收集、分析.由表1可以看出,收集7 d纯槐酸)出现--馒头峰,无法分开.所以,再次试验时将时的根系N案分泌物中精氨酸和甘氨酸含量较高,占间延长至7 d,并用去离子水进行循环,以收集根系游离氨基酸总量的43.2% ;纯杨的根系N素分泌物分泌物,结果表明根系分泌物中氨基酸类物质的量明中赖氨酸和精氨酸含量较高,占游离氨基酸总量的显加大,达到了可以检出的水平(下面将详细讨论).66.0%;混栽刺槐、杨树根系N素分泌量中精氨酸和2.2.3根系分泌物中鞣酸对收集 N素物质的影响赖氨酸含量较高,占游离氨基酸总量的78.8%.将.在收集根系N素分泌物时发现，树脂柱上明显每一处理的根系分泌物折算到单株上,则纯栽刺槐富集一些白色物质，而且洗脱后的流出液比色时产氨基酸分泌总量为1.543 u/(周.株),纯栽杨树氨生大量的白色沉淀物质,用醋酸铅鉴定是鞣酸物质基酸分泌总量为0.715 ug/(周.株),混栽苗木氨基在起作用.为了排除其可能造成的干扰，-方面我们酸分泌相对总量为0.657 u/(周.株),纯槐单株根.在接柱收集时将树脂柱上加少许玻璃纤维,这样既系N素分泌物中氨基酸的含量远大于纯杨和混栽，可以阻挡大分子的鞣酸,也可以防止循环收集时冲分别是二者的2.2和2.3倍.混栽苗木根系N素分动树脂:另一方面,在洗脱前用蒸馏水多次冲洗树脂泌物相对总量明显低于纯槐,而栽培装置是全封闭，柱.这两种方法均能除去大部分鞣酸和其它杂质.另那么混裁中刺槐根系分泌的氨基酸为何减少?有苗10北京林业人学学报第25卷木根系生物量不同的可能因素,更可能的是盆栽中长.如何解决延长收集时间与为苗木补充营养间的苗木根系发达导致混栽刺槐与杨树的根系相互交错矛盾,需进一步的分析和研究.接触,刺槐根系分泌中大量的氨基酸通过根系接触(4)精氨酸和甘氨酸是纯栽刺槐根系分泌物中的途径直接转移给杨树.假设以纯裁苗木单株分泌的主要氨基酸,而精氨酸和赖氨酸是纯栽杨树以及的每种氨基酸量为标准值按株数折算出混栽苗木的混栽苗木根系分泌物中的主要氨基酸.纯栽刺槐单理论分泌量则可以获得更多信息,结果表明(表1),株根系氨基酸类N素分泌物总量高出纯栽杨树和混栽苗木根系分泌物中大部分氨基酸和总量的实际混栽苗木的2.2倍和2.3倍.混栽刺槐单株根系氨值大大小于理论值,其中苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙.基酸类N素分泌物含量的减少有可能是杨树吸收氨酸缬氨酸等下降的幅度非常大,但组氨酸和赖氨的结果.以纯栽苗木单株分泌的每种氨基酸量为标酸则例外,其实际值要显著高于理论值,说明混栽可准值，按株数折算出混裁苗木的理论分泌量,表明混刺激这两种氨基酸的分泌,至于其生物学意义还需栽苗木根系分泌物中大部分氨基酸和总量的实际值进一步探讨.大大小于理论值.其中苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨从利用循环水根系分泌物收集装置7 d研究的酸、缬氨酸等下降的幅度非常大,但组氨酸和赖氨酸结果看,循环水根系分泌物收集装置结合D061型树则例外,其实际值要显著高于理论值,说明混裁可刺脂柱对氨基酸类N素根系分泌物的收集是确有成激这两种氨基酸的分泌,至于其生物学意义还需进效的:D061型树脂对氨基酸的交换吸附具有相对广一步探讨.泛性,循环水根系分泌物收集装置的设计应用为长(5)循环水根系分泌物收集装置可广泛用于各时间连续收集根系N素分泌物提供了条件,仅仅一种植物的根系分泌物收集,但收集树脂则需根据所周时间已经收集到多种氨基酸,并已达到可检出的收集的根系分泌物类型不同而不同.量.但同时也可看出一-周收集的结果,各盆栽根系分泌物氨基酸的含量总的来说是非常低的,有些氨基参考文献酸含量在分析过程中呈现为痕量,说明收集时间过短.如何解决延长收集时间与为苗木补充营养间的沈国舫,翟明普.森林培育学.北京:中国林业出版社,00沈国防,贾黎明，翟明普.沙地杨树刺槐人工混交林的改良土壤功能及养分互补关系，林业科学1998,34(5);12-203结论与建议3贾黎明,翟明普,胡廷杰，等。杨树刺槐种间磷素营养关系。见:沈国舫主编.混交林研究.北京:中国林业出版社199750-57(1)循环水根系分泌物收集装置设计成功，能4 贾擊明,看明普,胡延杰，等.杨树剌槐种同氨素养分转移.见:够正常运转,真正实现了在现实栽培条件下无损根沈国舫主编.混交林研究.北京:中国林业出版社19979.41-49系、实时、连续、富集、定量、准确收集和研究根系分5贺伟,贾黎明。棍栽杨树-剩槐间磷素养分转移途径的研究.应泌物,这为根系分必物的深人研究提供了方法上的用生态学报2003,14(4):481-4866张福锁.环境胁迫与植物根际营养。北京:中国农业出版社，保障.1998(2)循环水根系分泌物收集装置运转正常和根7陈华君，金幼薯,王沙生,盆栽杨树刺槐根系及其分泌物的生化系氨基酸类根系分泌物成功收集需要注意一些细成分，见:沈国舫主编.混交林研究北京:中国林业出版社，节.其中消除Hogland营养液对收集根系氨基酸类1997. 78-87N索分泌物的影响、消除根系分泌物中鞣酸对收集8张彦东,王庆成,李森友。水曲柳落叶松根系分泌物对土壤磷吸N素物质的影响、确定恰当的收集时间等非常重要.附与解吸的影响。见:沈固舫主编.混交林研究,北京:中国林业(3)循环水根系分泌物收集装置结合D061型出版社,155-1589 Tung C s, Young C C. Cllction end ientificatio of llopahie com树脂柱对根系分泌物的收集确有成效，仅仅一周时.pounds from the undisurbed root syte o Bjgala Limpognass ( Hemar-间已经收集到多种氨基酸,并已达到可检出的量.但thria alisima). PI Plysiol .1982 ,69: 155-160同时也可看出一周收集各盆裁根系分泌物氨基酸的含量总的来说是非常低的,有些氨基酸含量在分析(责任编辑胡涌)过程中呈现为痕量,说明收集时间还太短,有必要加