聚乙二醇修饰纤维素酶的性能研究

2012 Joumal期 of Qingdao Uni技大学学报自然科学 Vol. 33 No.2 nce and Technology( Natural Science Edition) Apr. 2012文章编号:1672-6987(2012)02-0131-04聚乙醇修饰纤维素酶的性能研究谢娟,李露苏忠亮,于世涛(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)摘要:以单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD5KD)为修饰剂,对纤维素酶进行化学修饰,得到修饰纤维素酶(mPEG-Cell)用mpe-Cll降解微晶纤维素,以所得还原糖量为标准(DNS比色法测定),考察各种因素对其催化性能的影响,确定最佳修饰条件。结果表明:在0.1mol·L-pH=4.8的柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲溶液中,纤维素酶质量浓度为5mgmL-1,m(mPEG-ALD):m(酶)=1:1,35℃修饰24h,所得到的 mPEG-Cell具有最佳的催化性能,在50℃下降解微晶纤维素,24h后可得还原糖量达到2.58mg·mL,比同条件下天然酶降解微晶纤维素得到的还原糖量多0.53mgmL-,即多26%关键词:纤维素酶;聚乙二醇丙醛;化学修饰中图分类号:Q556文献标志码:A Chemical Modification of Cellulase with Polyethylene Glycol-aldehyde XIE Juan, LI Lu, SU Zhong-liang, YU Shi-tao (College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042. China) Abstract: The modified cellulase(mPEG-Cell)was obtained by using polyethylene glycol- aldehyde (mPEG-ALD) as modifier. The mPEG-Cell was used to degrade microcrystal- line cellulose and the effects of various factors on its catalytic properties were investiga- ted based on the amount of obtained reducing sugar( by DNS colorimetric analysis) The obtained optimum conditions were using 0. 1M citric acid-sodium citrate as buffer (pH=4.8), concentration of cellulase 5 mg.mL-I m(mPEG-ALD): m(Cellulase)= 1: 1, temperature 35 C and time 24 h. The mPEG-Cell obtained under above condi- tions was used to degrade microcrystalline cellulose at 50 C for 24 h, the amount of re- ducing sugar could reach 2. 58 mg. mL-', which was 0.53 mg. mL-I(26%)more than that obtained by using natural cellulase. Key words: cellulase; polyethylene glycol-aldehyde; chemical modification随着石化资源的逐渐枯竭,利用可再生资源进而转化成乙醇丙酮、丁醇等燃料和化工原生产生物能源的研究越来越受到国内外研究者的料。但是纤维素酶降解纤维素存在酶活性低,关注纤维素作为世界上最丰富的天然可再生资与纤维素可及性差,酶稳定性差,条件苛刻等问源,其开发与利用对解决人类面临的资源和能源题阻碍了纤维素酶解的进一步发展,降低了对纤危机具有重要意义。作为纤维素资源化利用有效维素的利用率2,因此对纤维素酶进行化学改性途径之一的酶解反应,可使纤维素降解为葡萄糖,成为改善其不足的有效手段之一收精日期:2011-10-17基金项目:国家自然科学基金项目(31070520)山东省高等学校科技计划项目(J09LG16);华南理工大学制浆造纸工程国家重点实骏室项目200912作者简介:谢娟(1986一),女,硕士研究生,通信联系人132青岛科技大学学报(自然科学版)第33卷目前国内外对纤维素酶化学改性的研究比较1.3实验方法少有研究者采用聚氧乙烯马来酸酐聚合物聚1.3.1化学修饰方法乙二醇和顺丁烯二酸酐、三聚氯氰活化聚乙二醇在装有温度计、冷凝管、转子的50mL三口(PEG)和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)焦碳酸二瓶中加入15mL一定pH的柠檬酸柠檬酸钠缓乙酯和碳二亚胺对纤维素酶进行修饰,以上方冲溶液。设定一定温度,待温度稳定后加入相应法存在活化剂毒性大、步骤繁琐、修饰酶不稳定等量酶粉,慢速搅拌溶解。称取相应量修饰剂缺点。聚乙二醇类修饰剂现多用于药物修饰,普(mpeg-ald)计时,混合均匀,再加入相应量还遍取得较好效果,与其它聚乙二醇类修饰剂相原剂(NaCNBH33)搅拌溶解,使终浓度保持在20比,单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)对蛋白mmol·ml-反应一定时间,加入3.0g甘氨质N末端氨基的选择性高,反应pH范围较宽,酸终止反应30min透析过夜,得到修饰酶液对蛋白质活性影响较小10,修饰产物均一性较(mpeg-Cell)高,有利于修饰产物的质量控制。因此,本研究尝1.3.2修饰酶活性测定试用单甲氧基聚乙二醇丙醛为修饰剂对酸性纤维按文献[11]绘制标准葡萄糖曲线,用于换算素酶进行化学修饰,以期提高纤维素酶的稳定性吸光度值对应的还原糖量进而提高其催化活性。以降解微晶纤维素为模型取15mL修饰酶液,加入0.30g微晶纤维素反应,明确修饰条件对酶活性的影响。(20gL-1),50℃下降解1h,采用DNS显色法1实验部分检测对应吸光度A值,根据标准葡萄糖曲线换算成相应还原糖量,衡量不同修饰条件得到的修饰1.1材料与仪器酶降解微晶纤维素的效果,以确定最佳修饰条件。单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)5KD,北京凯正生物工程有限公司;氟基硼氢钠2结果与讨论(NaCNBH3),阿拉丁试剂;微晶纤维素(MCC),2.1修饰温度对mpeg-cell催化活性的影响成都科隆化工试剂厂;纤维素酶,上海源叶生物科在pH=4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液技公司;透析袋,美国Aikb公司;3,5-二硝基水杨中,酶质量浓度3mg·mL-1,m(mPEG-ALD):酸、柠檬酸、柠檬酸钠、甘氨酸、EDTA、碳酸氢钠m(酶)=1:1,修饰24h的条件下,考察不同修等试剂均为分析纯。饰温度对纤维素酶修饰效果的影响,结果见图1.紫外光度计,UV755B型,上海精密科学仪器有限公司。2.71.2修饰反应原理2.42单甲氧基聚乙二醇丙醛与蛋白质分子N端1.8的氨基通过曼尼希反应生成希夫碱,经氰基硼氢151.2钠(NaCNBH3)还原形成比较稳定的亚胺连接体。画09反应式如下:0.60.3005101520253035404505560 mPEG-CH+NH2蛋白质冷凝℃图1温度对 mPEG Cell催化活性的影响N蛋白质 Fig.1 Influence of temperature on catalytic activity of mPEG-Cell mPEG-CH +H2ON蛋白质由图1可见,起初随着温度的升高,修饰酶活还原性逐渐提高;修饰温度为35℃时,达到最大值;再 mPEG-CH+NaCNBH3升高温度,活性反而下降。这是因为纤维素酶的mpech2-nh-蛋白质化学本质是具有催化活性的蛋白质,其活性具有最适宜温度,在此温度以下,其活性随温度的升高第2期谢娟等:聚乙二醇修饰纤维素酶的性能研究133而增强,超过该温度,酶的构象将发生改变,其饰效果逐渐平缓,再增加酶用量对增加修饰效果活性减小,当温度过高,纤维素酶将完全变性,丧不大。因此,适宜的酶用量为5mgmL-1失催化活性。因此,适宜的修饰温度为35℃2.2修饰体系pH对mpeg-ell催化活性的影3.0响25在酶质量浓度为3mg·mL-1,m(mpe82.0ALD):m(酶)=1:1,35℃修饰24h的条件1.5下,考查不同pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液对1.00.5纤维素酶修饰效果的影响。在修饰剂类型、相对分子质量固定的情况下,修饰反应条件对单修饰c(纤维素mgm产物体外活性保留的影响主要取决于修饰位点。只有修饰位点远离蛋白质活性部位的时候,修饰图3纤维素酶浓度对 mPEG-Cell催化活性的影响 Fig.3 Influence of cellulase concentration on蛋白才能得到较高的活性保留。不同氨基酸残 catalytic activity of mPEG-Cell基,其pK,值不同,因而在不同的pH值条件下,其亲核性有较大差别因而溶液的pH值影响了2.4mpeg-ald用量对mpeg-cel催化活性的蛋白质的修饰位点,是影响修饰产物活性的最主影响要的因素。图2显示了pH对 mPEG-Cell催在pH=4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液化活性的影响。可以看出,mEGCell的活性随中,酶质量浓度为5mg·mL-,35℃修饰24h着pH值的增大先增大后减小,在pH=4.时的条件下,考查不同的修饰剂与酶质量比对纤维 mPEG-Cll活性最高。在pH=4.8的条件下,素酶修饰效果的影响,结果见图4由图4可见,有利于纤维素酶非活性氨基基团的暴露,增加其随着修饰剂和酶配比逐渐增加,修饰酶效果先增与 mPEG-ALD修饰基团的接触位点,提高修饰大后减小,在质量比1:1时达到最大值。可能是度,以利于保持和稳定 mPEG-Cell的空间构象,由于修饰剂和酶配比的增加,使得酶和修饰剂分使其具有较高的活性12。因此,适宜的修饰pH子的碰撞机会增大,促进了修饰反应的进行,但是为4.8修饰反应消耗活性氨基基团,使酶活性明显下降,导致修饰酶解效果下降。因此,适宜的配比为272.4212.7261.5251.22.40.92.30.62.20.32.103.24.04.85.66.42.01.9 pH1.81.7图2反应体系pH对 mPEG-Cell催化活性的影响23 Fig.2 Influence of pH on catalytic activity of mPEG-Cell m(mPEG-ALD): m()图4修饰剂 mPEG用量对Cell催化活性的影响2.3纤维素mPEG-Cell酶浓度对催化活性的影响 Fig.4 Influence of modi fier dosage on在pH=4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液 catalytic activity of mPEG-Cell中,m(mpeg-ald):m(酶)=1:1,35℃修饰2.5反应mPEG-Cell时间对催活性的影响24h的条件下,考查不同酶质量浓度对mEG在pH=4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液Cell催化活性的影响,结果见图3.由图3可见,中,m(mPEG-ALD):m(酶)=1:1,酶质量浓度起初随着酶用量的增加, mPEG-Cell催化活性逐为5mg·mL-1,35℃的条件下考查不同反应时渐上升,但是当酶用量超过5mgmL之后修间对 mPEG-Cell催化活性的影响,结果见图5134青岛科技大学学报(自然科学版)第33卷由图5可见,随着修饰时间的加长,修饰效果逐渐原糖量比天然酶多0.53mg·mL-1(即多26%)。增强,24h后趋于平缓。随着反应时间的增加在聚乙二醇链的作用下纤维素酶的稳定性增强, mPEG-ALD与酶之间的结合量增加促使酶的结同时修饰酶活性中心外露更易与纤维素接触结合位点外露,增加其构象稳定性,mPEGCell催合,使修饰酶催化中心更好的降解纤维素,从而增化效果显著增加,到24h后, mPEG-ALD与酶之加还原糖的量间的结合度基本达到饱和, mPEG-Cell催化效果变化不明显。因此,适宜的修饰时间为24h3结论采用单甲氧基聚乙二醇丙醛化学修饰纤维素3.0酶,使得修饰后的纤维素酶mpeG-Cell比天然酶25具有了更好的稳定性和催化活性。在0.1mol20L-1pH=4.8的柠檬酸柠檬酸钠的缓冲溶液中,1.纤维素酶质量浓度为5mg·mL-1,m(mEG1.0ALD):m(酶)=1:1,35℃修饰24h,所得到的纤维素酶 mPEG-Cell,在50℃下降解微晶纤维0.5061218243036424854素,24h后得到的还原糖量比同条件下天然酶降解微晶纤维素得到的还原糖量多0.53图5反应时间对 mPEG-Cell催化活性的影响mgmL-(即多26%)本研究为提高纤维素酶 Fig. 5 Influence of reaction time on的活性和稳定性又开辟了一条新的途径。 catalytic activity of mPEG-Cell参考文献2.6mpeg-cell与天然酶降解微晶纤维素催化效果比较] Ragauskas J. The path forward for biofuels and biomaterials mPEG-cell(50mL3mg.ml-)与天然酶488.(50mL3mg·mL-1)在50℃下降解140mg微[2]夏梅吴红平,张玥,等离子液体的制备及其在酶催化反晶纤维素,分别检测降解1,3,6,9,12,24h后得应中的应用[化学进展,2006,18(12):1660-1671化学进到的还原糖量。[3]张松平王平化学修饰提高酶催化性能的重要工具]生物加工过程,2006,4(1):4-15.[4]刘靖,夏文水焦碳酸二乙酯及碳二亚胺对纤维酶壳聚糖天然酶双功能酶的修饰作用]食品科学,2008,29(8):4602.1[5]张裕卿,李滨县修饰纤维素酶催化提取薯费皂素的方法:1.8中国GB1966712ALP]2006[6]张裕卿,李滨县聚氧乙烯马来酸酐聚合物改性纤维素酶催11.2化酸水解盾叶薯薯皂苷元的研究[]中草药,2007,380.9(4):527-532.0.6 [7] Zhang Q. Modification of cellulase and its application to0369121518212427 extraction of diosgenin from Dioscorea xingiberensis C.H. Wright [] Biochemical Engineering Journal, 2009,47 80-86.6 mPEG-Cell与天然酶降解微晶纤维素对比[8]刘霞,丁志山,蒋福升秦乙二醇修饰小分子药物的研究进 Fig.6 Contrast between MCCs degraded展)[]中国药理学与毒理学杂志,2010,24(5)380-386. by mPEG-Cell and cellulase醇定点[9]王旭东,李晓晖蛋白药物的聚乙二醇定点修饰策略与最佳的位点[中国生物工程杂志,2010,30(4):101-109由图6可见,随时间的增加在两种酶催化下10]许培戎隆富乙二醇修饰天花粉蛋白的初步研究中国新药杂志,2006,15(5):154-348.的微晶纤维素所得到的还原糖量都在逐渐增加,11]张永风,卢红梅酸性纤维酶酶活力的测定酿酒科最初天然酶和mpE-Cell催化效果基本相当,但技,2007(12):99-101随着降解时间的增加,mp-Cell的优势逐渐增[12]郭工程[M].北京:科学出版社29138-141强,24h后mpeg-Cell降解微晶纤维素得到的还(责任编辑林琳