巯基乙醇对黄粉虫NAGase活力的影响

第24卷第4期泉州师范学院学报(自然科学)VoL 24 No 42006 F 7 a Journal of Quanzhou Normal University(Natural Science) Jul 2006巯基乙醇对黄粉虫 NAGase活力的影响谢晓兰,潘小芳,刘小强(泉州师范学院化生学院,福建泉州362000摘要:以黄粉虫幼虫为材料,采用0.05mol/LpH7.5 Tris-HCl缓冲液抽提、硫酸铵分级分离提取N乙酰D氨基葡萄糖苷酶( NAGase, EC3.2.1.52),获得比活力1025u/mg的酶制剂,研究 NAGase催化 PNP-NAG水解反应的动力学参数测得米氏常数K=0.384mmo/L,探讨巯基乙醇对该酶活力的影响.结果表明巯基乙醇对该酶活力具有显著的抑制作用,其抑制作用显示可逆过程研究巯基乙醇对该酶的抑制类型显示其抑制效应为混合型,K1和KB分别为1.9%和9.6%关键词:黄粉虫;N-乙酰PD·氨基葡萄糖苷酶;巯基乙醇;抑制作用中图分类号:Q556.1文献标识码:A文章编号:1009-8224(2006)04-0101-05几丁质酶系是由内切几丁质酶外切几丁质酶和N乙酰BD氨基葡萄糖苷酶( NAGaseEC321.52)等3种不同组分组成的(,它们协同作用将多聚壳聚糖分解产生N乙酰BD氨基葡萄糖,该酶的降解产物在生命科学医学、化工、农业及环境科学等方面潜在的应用价值已受到越来越广泛的关注N乙酰BD氨基葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物、微生物中,在抗菌防御,几丁质的消化吸收,昆虫与甲壳动物的蜕壳及孵化过程中起着重要的作用.1986年,Koga等报道分别从家蚕表皮层和消化道中纯化得 NAGase,并通过进一步研究发现分布在表皮层的酶与其蜕皮生长成虫化蛹有关,并受蜕皮激素调节;而分布在内脏的酶其主要功能是消化含几丁质的食物,与蜕皮生长无关2.最近,黄小红也报道了棉铃虫 NAGase的分离纯化及酶学性质黄粉虫( Tenebrio molitor linneeus)富含蛋白质氨基酸、人体必需的不饱和脂肪酸、甲壳多糖等,是一种极具潜力和前途、经济的资源,被专家称为是继蜜蜂、家蚕之后第三大昆虫产业,但关于黄粉虫 NAGase还未见报道本文以黄粉虫幼虫为研究材料,分离提取其 NAGase.以巯基乙醇为效应物,研究它对 NAGase酶活力的影响.这将有助于了解黄粉虫 NAGase三维空间结构与酶活力关系;利用酶促反应动力学原理研究巯基乙醇对酶的抑制类型及抑制常数的计算将有助于了解酶的催化机制及酶活力的调控,为酶的结构与功能研究奠定基础,在酶学理论研究上具有重要的意义.收稿日期:2006-04-25作者简介:谢晓兰(1974—),女,福建惠安人,讲师,博士,从事有机化学、生物化学方面的研究资助项目:福建省教育厅科技计划项目(JA04260)102泉州师范学院学报(自然科学)2006年7月1材料与方法1.1材料黄粉虫幼虫购自厦门花鸟市场实验室饲养后取样冷冻备用对硝基苯N乙酰D氨基葡萄糖苷酶( PNP-NAG)为上海医药工业研究院产品;考马斯亮蓝试剂(G250)结晶牛血清白蛋白分别是上海蓝季科技发展有限公司进口分装、国产分装;三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)等其他生化试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产;疏基乙醇及其它化学药品均为国产分析纯;所用蒸馏水为单蒸水1.2方法1.2.1黄粉虫 NAGase的提取以黄粉虫幼虫为提酶的材料,称取定量的冷冻黄粉虫幼虫研磨成浆后,按3:1(V/W)的比例加入预冷的0.05mo/LpH=7.50 Tris-HCl缓冲液,置4C下抽提1h.4C、15000rpm离心30mn,虹吸中层清液,弃去沉淀与表层漂浮的油脂.往所得清液中加入研细的固体硫酸铵粉末至30%的饱和度,4℃下盐析4h,4℃、15000rpm离心30min,虹吸中层清液,弃去沉淀杂蛋白与表层漂浮的油脂缓慢追加研细的硫酸铵粉末至70%的饱和度,4℃下盐析4h,4℃、15000rpm离心30min,弃上清液,收集沉淀,沉淀用少量0.05mol/L、pH=7.50 Tris-HCl缓冲液溶解,并在4℃冰箱中对此缓冲液进行透析,直到SO3被检测出为止,透析液于4C、15000rpm离心30min,收集得酶活力为246u/ml,比活力为1025u/mg的酶制剂1.2.2酶蛋白浓度的测定见文献[5]方法,以结晶牛血清白蛋白作标准曲线,采用考马斯亮蓝染色结合法测定蛋白质浓度1.2.3酶活力的测定酶活力的测定见文献[6]体系含0.25mmol/L的底物,加入50l(酶蛋白浓度为240g/ml)粗酶液,准确反应后在721E型可见分光光度计上测定波长为405nm的吸光度,以pNP为产物对照测得该条件下产物的消光系数为1.73L/( mol cm)酶活力单位定义为在上述条件下,每分钟水解底物产生1mol/L产物的酶量1.2.4酶催化 PNP-NAG水解的动力学参数测定采用以上酶活力测定的方法,改变底物浓度[S],测定酶促反应的初速度v,以v对[S]作图,为典型的米氏双曲线关系,采用Lineweaver-Burk双倒数法作图,以1/v对1/[S]作图,从直线的截距求得该酶催化 PNP-NAG水解的米氏常数Kn和最大反应速度Vn1.2.5巯基乙醇对酶活力作用的测定采用以上酶活力测定的方法,在测活体系中,加入不同浓度的巯基乙醇测定出酶的相对活力,分析它们对酶活力的影响1.2.6巯基乙醇对酶活力的抑制常数测定采以上酶活力测定的方法,固定底物浓度为0.25mmol/L,含不同浓度的巯基乙醇测活体系中,研究酶量与酶活力的关系,分析它们对酶的抑制机理;抑制类型的判断是采用1.2.4方法,通过 Lineweaver-Burk双倒数作图,比较酶催化反应的动力学参数,包括表观米氏常数(Km)和最大反应速度(Vn)的变化2结果2.1酶催化 PNP-NAG水解的动力学参数的测定用1.2.4方法,测定黄粉虫 NAGase粗酶制剂在pH5.2的缓冲体系下,催化 PNP-NAG第4期谢晓兰等:巯基乙醇对黄粉虫 NAGase活力的影响103水解的动力学参数.如图1所示,酶促反应初速度与底物浓度成典型双曲线关系,说明酶催化PNP-NAG水解反应遵循米氏方程,以 Lineweaver-Burk双倒数法作图,得到一条直线,由直线横轴截距求得在pH52的测活体系下,酶水解 PNP-NAG的Km值为0384mmol/L,Vn为31.2mol/L/min00602040.66810[s]/ mmol.·L图1黄粉虫 NAGase催化 pNP-NAG图2巯基乙醇对黄粉虫 NAGase活力的形响水解反应的动力学参数测定2.2巯基乙醇对酶活力的影响以巯基乙醇为效应物,在0.0~20.0%浓度范围内研究其对酶活力的影响,结果见图2图2表明巯基乙醇对该酶活力的影响呈近S型的下降趋势,刚开始,巯基乙醇对酶活力的抑制较轻微,随着浓度的增髙,酶活力下降幅度增大,当达到高浓度时,酶活力下降趋于平稳.其致使酶活力下降一半所需的浓度(IC50)约为6.0%,当殖基乙醇的浓度为20.0%时,它可以使酶活力下降95%左右.2.3巯基乙醇对酶的抑制失活作用以巯基乙醇为效应物,在含0.25mmol/ L PNP-NAG和不同浓度巯基乙醇的测活体系中,改变酶量,测定酶催化反应的活力图3表示酶的剩余活力与酶量的关系,结果表明:酶活力对酶量作图得到一组通过原点的直线,随着巯基乙醇浓度的增高,直线的斜率降低.说明在考察的浓度范围内,巯基乙醇对酶的抑制失活作用是可逆过程,巯基乙醇通过抑制酶活力而导致催化效率的降低,而不是通过降低有效的酶量导致活力的下降2.4巯甚乙醇对酶的抑制失活作用类型及抑制常数的测定在测活体系中,固定加入的酶量,改变底物浓度,测定不同浓度巯基乙醇对酶活力的影响,以 Lineweaver-Burk双倒数作图,判断巯基乙醇的抑制类型,结果见图4.由图4可知,双倒数作图得到一组相交于第二象限的直线,说明巯基乙醇对酶的Km值和Vn均产生影响,v值随着巯基乙醇浓度的增大而减小,而K灬值随着巯基乙醇浓度的增大而增大.说明巯基乙醇对 NAGase的抑制作用表现为混合型抑制作用,巯基乙醇既影响酶的催化反应又影响了酶与底物的亲和力以双倒数图的各直线斜率及纵轴截距分别对巯基乙醇浓度作图,均为一直线,测定其对游离酶的抑制常数K1与对酶-底物络合物的抑制常数Ks分别为1.9%、9.6%104泉州师范学院学报(自然科学)2006年7月0600.50150.40004051015200.060043.00.10002010203040500[E]/μLs]/ moli·L图3巯基乙醇对黄粉虫 NAGase失活作用机图4巯基乙醇对黄粉虫 NAGase抑制作用类型的判断理的判断,直线0-4的巯基乙醇浓度分直线0-4的筑基乙酵浓度分别为:0,5%,7.5%,别为:0,5%,7.5%,10%12.5%10%,12.5%.3讨论昆虫 NAGase主要分布在消化道及外壳膜,能催化几丁质的降解和合成,在昆虫的生长发育、形态变化过程中旧壳的蜕换及新壳的形成起着重要作用.本文以具有广阔开发应用前景的黄粉虫为材料,经0.05ml/L、pH7.5 Tris-hCl缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀等生物分离技术制得酶蛋白浓度为240g/ml的粗酶制剂.在pH5.2、0.1mol/ L NaAc-HAc缓冲液的测活体系下,对黄粉虫 NAGase催化 pNP-NAG水解反应的动力学参数进行了测定,得出米氏常数Kn=0.384mmol/L;同样温度下,在pH5.2、0.15mol/ L NaAc-HAc缓冲液下,测得凡纳对虾( Penaeus vannamei Prawn) NAGase催化 PNP-NAG水解反应的米氏参数Kn为0.254mmol/L;在pH5.8、0.05mol/ L NaAc-HAc缓冲液下,测得锯缘青蟹(Sylaserrata) NAGase催化 PNP-NAG水解反应的Kn为0.424mmol/L;在pH5.6、0.1mo/LNaH2PO4Na2HPO缓冲液下,测得棉铃虫( Helicoverpa armigera)蛹 NAGase催化pNPNAG水解反应的Kn为0.160mmo/L3.可见,不同来源的同种酶具有不同的催化动力学特性,比较三种不同来源的酶的米氏常数,结果显示黄粉虫 NAGase对底物 PNP-NAG的亲和力比棉铃虫和凡纳对虾 NAGase低,但比锯缘青蟹 NAGase高.巯基乙醇是维持酶蛋白三级结构二硫键的主要修饰剂80,它的导入可导致酶蛋白二硫键被破坏,引起酶三维结构的松散导致酶的变性失活.不同的酶由于结构不同,引起变性失活所要求的巯基乙醇的浓度也不尽相同本文的实验结果显示巯基乙醇对黄粉虫 NAGase活力的影响呈近S型的下降趋势,小浓度的巯基乙醇破坏酶三级空间结构的表面二硫键,这些二硫键对酶活性中心的影响不大,酶活性中心处于酶整体结构的内部.进一步研究巯基乙醇对酶的失活作用动力学结果显示巯基乙醇让酶产生可逆的混合型抑制失活.并测其对游离酶及酶底物络合物的抑制常数,结果显示K1值小于Ks值,显示底物对酶的失活具有一定的保护作用第4期谢晓兰等:巯基乙醇对黄粉虫 NAGase活力的影响105参考文献[1 Broadway RM, williams DL, KaIn WC, et al. 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The inhibitory kinetics ofmercaptoethanol on the enzyme was further studied. The result showed that it was reversiblemixed typed inhibitor of the enzyme. The inhibition constants of mercaptoethanol for NA-Gase K, and K Is were determined to be 1. 9% and 9. 6%, respectively.Key words: Tenebrio molitor Linneeus i NAGase; mercaptoethanol; inhibitory mechanism