RAPD的建立及优化研究

436重庆医科大学学报2001年第26卷第4期(Joumal of Chongqing Medical Lniversity 2001. VoI 26. No.4)文章编号:0253 - 3626(2001)04 - 0436 -03.RAPD的建立及优化研究蒲淑萍',玉希,段昌柱'(1.重庆医科大学基础医学院生物学教研室重庆4006;2 重庆职工医学院生物学教研室重庆 40050)[摘要]目的:建立优化的RAPI)反应条件,为进 步进行遗传监控研究奠定基础。方法;按常规方法制备小鼠基因组DNA.在-定的RAPD)- PCR反应条件下分别改变各组份浓度及退火温度。扩增产物在含溴化乙锭的1. 5%琼脂糖凝胶中电泳,紫外透射仪上观察照相、结果:当Mg*浓度为1. 5mmx)/L.4种dNTPs各为150;mo!/L,Taq酶为1. sUi,引物为0. 2moul/..模板INA为50ng.退火温度为38“.RAPD-PCR扩增效果好。结论:在优化的条件下规范操作,RAPD的稳定性.重复性好[关键词] RAPI);基因组DNA:优化反应条件[中国围书分类法分类号] R394. 33(文献标识码] B(收稿日期] 2001-01 -03Screening the optimized condition of RAPD - PCRPU Shu- pring ,et ul(Iepartment oi IBiology ,College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University )[:Abstract] Obecive :To establish the optimized RAPD- PCR reaction conditions for furher genetic monitor-ing sudy. Methods : :Altering the cuncentrations of the reaction components and the annealing lemperaturt ofRAPI)- P(R. PCR products from RAPD were elcctrophoretically separated in agarose gels and banding profileswert visualized by ethidium bromide saining. Results : RAPD - PCR reactions were performed in duplicationwith 50ng of genonic DNA. I50pmol/L each dNTP,0. 2pxmol/L primer, 1.5mmol/L magnesium chlride,1. 5units of Taq prlxmerase, annealing at 38亡. Under thee conditions RAPD method is stable and reproducible.Conclusion :'Ihe optimized RAPT) - PCR reaction conditions were cstablished in this study.[Key words] Randor anplified polynorphic DNA( RAPD) ;Grenonic DNA:Optimal reactin conditions1990年Willians "和Welshl]等几乎同时将随或发生分子量的改变,形成多态DNA片段.通过对机引物与PCR技术结合,用于复杂基因组DNA指PCR扩增产物的检测即可找到基丙组DNA在这些纹分析,Williams等称之为随机扩增多态DNA(ran-区域的多态性。RAPD 技术的特点之一是使用随机dom anpified polymorphic DNA. RAPD)分析,引物,通过系列引物可检测到覆盖整个基因组范Welsh等称之为AP - PCR ( arhitrarily primed围的遗传改变.而无须预先了解被测基因组相关分PCR): RAPD与AP- PCR并尤本质的区别,均为子生物学信息。另一显著的优点在于RAPD技术种基于PCR方法,应用单一引物的DXA多态检相对简单、快捷、实验成本较低，加之有大量商品化测技术.该技术利用一系列单-的喊基序列随机排的RAPD引物,可对任何生物的遗传变异进行基因列的矩寡核苷酸为引物.对基囚组DNA进行PCR分型其因型鉴定扩增.每引物同基因组DNA序列有其特定的结因而中国煤化工的外七广泛应用合信点.如果基因组在这些区域发生DN:A片段插于动YHCNM HG国的构建,狭病人，缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点诊断,基因分离等:随机引物法亦已用于检测大的分布发生相应的变化.从而使扩增产物增加缺少肠癌,卵巢瘺、肺癌、皮肤癌.脑膜留等的基因组不稳序青数搪女芦i的2- ，女。重庆江津人、进海。确士 主要研定性及分离差异INA片段,并将其克隆和定位:“气方向.动境楚人类疾确遗传鸣RAPD反应非常灵敏,但稳定性.重复性不太令人满.重庆医科大学学报 2001年第26卷第4期(Journal of Chongaing Medicai University 2001. Vol. 26.No. 4)_437 __意:为了克服这一缺陷,本研究对RAPD-PCR反温度。实验结果表明,当Mg2*浓度为1. 5mmol/L,应的各项组份.诸如模板DNA、Taq酶、镁离子.引4种dNTPs各为150pmol/L,Taq酶为1.5U,引物物、dNTP等进行浓度梯度比较实验,以期建立最优为0.2μmol/L,模板DNA为50ng, 退火温度为反应条件。同时使用同一PCR仪,同一公司生产的38C ,扩增效果较理想。经大量实验证明,在此条件Taq酶,获得稳定性、重复性良好的扩增产物。下规范操作,RAPD的稳定性、重复性好:2.1 退火溫度对PCR的影响1材料与方法实验中分别设置35t: , 38C,40T ,42个,45T退火,温度过低(3SC )则特异性差,背景深;温度过11材料高(45C),扩增带减少、变弱,扩增效率低，在保证(C;,BL/6] 小鼠购自重庆医科大学实验动物中心,取小扩增效率的同时又要达到增强特异件的目的.我们鼠肝脏组织备用。认为38C较适宜。退火温度较低,能保证短核苷酸1.2 试剂与引物引物与模板的稳定配对,同时也允许了适当的错配，10 < bffr.Taq DNA聚合酶MgCl、dNTP均为上海生以大引物在基因组DNA中配对的随机性物T.程公司产品。随机引物为美国hperon Tecunologies公司产品.每- 引2.2 Mg°浓度对PCR的影响物为10个碱基的寡聚核许酸.实验用引物为AB- 0320 -Mg?*直接影响聚合酶的活性,它使双链DNAKit2-2即(:AB2-2):GGTGRGHAA;.B7-I:的Tm值增加, Mg*'与dNTPs形成的复合物才是CAHCOC(; AH8 - 12: GACGCGAACC; AR9 - 7:聚合酶作用的底物，因此Mg2*浓度对PCR扩增TCCTCCCGA等.的效率和特异性具显著影响[7]。实验中分别以13 基因组DNA的制备0. 5mmol/L.I. 5mmol/L .2.0mmol/L、2.5mmol/L、取小鼠肝脏组织适量,加少量液氟研碎,按常规方法加3.0mmol/L的Mg2*浓度进行扩增,结果如图1,浓人消化液(10runol/L Tns- HCI,pH8. 0, 10mno/L EDTA.度高则出现非特异扩增,背景深;过低则酶活性显著0 5% SDS.20/g /ml R.Nase, I00pg/ml蛋白酶K)消化.用酚、下降。由于反应混合物的模板DNA、引物、dNTPs氯仿提取DNA,乙醇沉淀.TE溶解,置4C冰箱备用:等均可结合Mg2* ,从而降低其游离浓度,特别是过.4 PCR仪:美国PE2400型量的dNTPs使其大量减少,导致P(R产物减少:1.5 RAPD- PCR反应条件及扩增程序参照Wlias!"I等的方法稍作修改后进行。反应总体从实验结果可知1. 5~ 2.0mmol/L的Mg'浓度其积为25u,其中含2. 5μ1 l0x bufer( 10mmol/L Tris- HC1.pH扩增效率和特异性较理想。bxe8δ. 3. 50mmol/L. KCI, 0. 001%明胶), 1. 5mmol/L MgCh，150umol/L dNTP,随机引物0. 2umol/L,25 - 50ng 基因组DN.A." Iag DNA聚合酶1.5个单位。反应程序为:94C预变性2min;94C变性1nin, 38C复性1min, 72七延伸2min,40个循环后,72C延伸10min。在以上条件下,分别改变退火1543温度、模板DNA浓度dNTP浓度.MgCl2浓度.Taq酶浓度、引物浓度,每次仅改变一个PCR参数,并保持其它条件不994变.扩增产物在含溴化乙锭的1. 5%琼脂糖凝胶中电泳,紫697515外透射仪上观察照相,3772结果与讨论中国煤化工虽然RAPD技术有许多其它分子生物学技术a0.5n.fYHCNMH GL2.0m1L1无法比拟的优点7.8. ,由于RAPD技术是以PCR技d. 2.5umnol/4.e.3.0mmol/L术为基础,加之短引物的使用及其在扩增过程中不(M:Maker)完全配对，影响最终产物获得的因素较多,其中最重2.3 dNTPs浓度对PCR的影响要的是衣数据dNTPs、引物、模板D:NA浓度和退火dNTPs是PCR反应的底物,其浓度过低则反应38重庆医科大学学报2001年第26卷第4期(!Jumal of Chongqing Medial Uhiversty 2001. Vol 26. No.4)速度和产量下降,过高则特异性下降。实验中2.5 模板 DNA浓度对PCR的影响dNTPs的浓度分别为50ymo!/L、 100umo/L.模板DNA用量从50ng至800ng.扩增结果基150ymolL20gumol/L.250xmol/L(图2)。在100本-致(图4)。模板DNA用量在+倍左右范围内~ 250)xmol/L之间扩增效果较好,故选择150pxmol/ 变动都不会影响扩 增结果,说明RAPD对模板浓度L用于实验.要求不十分严格。但本实验证明若模板DNA降解2.4 Taq酶浓度对PCR的影响严重或质量太差(如含杂质过多,DNA提取过程中如图3,25μI反应体系中Taq酶的用量分别为残留的蛋白酶、核酸酶、SDS、酚、氣仿等,可抑制0.5U、1.0U、2.0U.3.0U、4.0U,当Taq酶为0.5UTaq酶活性),出现扩增产物减少,背景弥散或无扩时,PCR产物量极少, Taq酶为3U以上时，出现了增产物191。为了避免模板严重降解,在提取DVA弥散状背景,非特异产物增加,Taq酶为1-2U时时应尽量避免剧烈或不恰当的操作,以便获得大分效果较好:子量的模板。实验中也曾用高浓度的基因组DNAdcbaMp作为模板,结果扩增产物很少或无扩增产物,这是因为模板DNA量大,其中抑制物量也可能增加,致使扩增效率下降。同时反应空间过分拥挤叮能也不利.于效率的提高。在对肿瘤与其相应止:常组织不同个体,不同品系间进行比较时模板浓度应尽量保持1543致:9942.6 引物浓度对PCR的影响引物浓度过低时会影响产量,过高时一则浪费.697515二则会出现非特异扩增9。实验中引物浓度梯度为0. lμmol/L.0. 2μmol/L .0.4umol/L .0.6umol/L、3770. 8ymnol/L)。0. 2μmol/L引物浓度最适宜:用2 dNTPs浓魔对RAPD结果的影响巾a.50;mol Lb. 100umolAL.c. l501mol/Ld. 20%m 1.e. 250umo!/L(M:Marker)bp97團4模板DNA浓度对RAPD结果的影响a.50ngb. 100ngc. 200ngd. 400nge.600ng1. S00ng中国煤化工YHCNMHG保持实验用品的一致性，如使用同- - 批次的TaqDNA聚合酶及同围: Taq 酶浓度对RAPD)结果的影响-台PCR扩增仪等。建立最优反应条件,严格规范a0孔L 1.0c.2.0U操作.可获得重复性、稳定性好的实验结果c3.00e↓0L万方数榍larker)(下转第442页)一442一1庆医科大学学报2001年第26卷第4期(Jumal of Changaing Medical University 2001. Vol 26. No.4)染性休克的病理变化的后期阶段起着重要的作用,nisns of cell simuation by barteral endotoxinJ]. Annu Rev在这一过程中可能属于后期细胞因子,与该病理变Immunol, 1995;13:437- 457.化严重程度及其预后密切相关。本研究结果提示，Wright SD, KRanas RA. Toblas IS.et al. CD.a化:eplur当E - STL< 150ng/ml,IL- 10< 19pg/ml时.有感for complexes of lipupxly srcharide (LPS) aud LPS bnding ;染进一步加重的可能;E - SLT> 328ng/nl,IL - 10proein[J]. Science, 1990;249:1431- 1433.[4] Bevilacqua MP, Stengelin s, (imbrane MA,et al. En->40pn/ml 时,患者预后不良，甚至有死亡的可能。duthelial leukocyle adhesion molecule - 1: an inducible receptor因此,我们认为同时测定IL- 10和E- SLT血清水for neutrophils related to complenen1 regulatory prstein and平在反映感染或感染性休克严重程度和预后上具有lecinJ]. Science, 1989;243:1160 - 1165.-定的价值和意义。[5] Bogdan C, Vodoworz y, Nathan C. Macruphage deactivn-本研究表明，sCD和TNF-a在术后并发严重tionby iterleukin- 10.]].」 Exp Mud. 1991; 174: 1549 -感染的早期病理过程中起着重要的作用,与早期感1555.染密切相关;IL- 10和E- SLT可能在感染病理变6] Bussolati H,Marian> F .Mrntrucchin (i.c1 al. Mudulatory化过程的后期起着重要的作用,属后期细胞因子,与elfet of Inteleukn - 10 (4 the pradu:tiun of platelet”aclivat.ing factor aund suproxide ariun bs bhuman leukxy1es.J. Im.感染严重程度密切相关。F.- SLT JL.- 10和sCD)4是反映术后并发感染病人病情变化和预后的可靠指nunolngy. 1997;9);440 - 447..7」 Kasun I, Surneter RM. L.ukacs NW,el小Repulatun of标之一:neurophil - derivd chenx kne expnsion by IL.- 10J].1 In-munl. 1997;152:3559 - 3569.参考文献8] Hickey MJ. Isckuz AC . Keinhardlt PH,et ail. Findk gtrnusinterlrukin- 10 regulates hem rynami: puraneler<. leukxcyet -1] Clauser MP. Zaneiti G, Beungrtner JD. et al. Sepsisenduthelial cell neractions, and mictovascular permerbilityshock;: ptogneisJ]. .1ce.e991:138:732 - 736.during enduxenia!]. (irs: Re. 1998;83:1121- 1131.2] Uerich RJ, Tobias PS. Receptor - dependent mecha.(-上接第438页)[s]常青,周开亚，F义权。等太湖猪遗传多样性和系统发生关系的RAPD分析[J].遗传学报, 199;26(5):480 -488.:6] Ong TM,Song B, Qian HW.et al. Detection of genomnicinsterbility in lung cancer tssue by randkm ampifed polyTmx)r-I j Wllians JG, Kubelik AR, Liavk KJ,et al. IDNA poly.-morphisns amplified by arbirary primers are useful a geneticphic DNA analysis. j]」. Carcinogenesis, 1998; 19(1):233- 235.[7] Coriey - Smith (iF Lim CJ, Kalnar (B.et al. Eficientmarkers[J]. Nucleic Acids Res,1990; I8:6351 - 635.[2] Welsh J and McClel and M. Fingerprinting genomes 四detetion of DNA polymorphisms by fluorscent R:APD) analysis[]. Bio Technique, 197:22:680 - 689.ing PCR with arbitrary priners[J]. Nucleic Acids Res, 1990;[8] Benter T, Papadxpuks S, Pape M. el l. Opinmiation18:213- 7218.[3] McClell and M and Welsh J. DNA fngrprining by arbi-and reprduibilit of random amplified palymuphic DNA inhuman[J].. Analyt Bochem. 1995;230:92 - 100.raily primed PCR[J]. PCR .Melh Appl, 1994;4:59 - s65.4」Del Tulo JP and Tingey: sw RAP) as - a nxvel tech.[9中国煤化工ncentration of prineranin randonn ampitiednique for genetic digaxisiJ]. Meth Mual Biol. 194;28:237poly |:TYHC N M H Gue, 19;14:352 --241.364.