海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件

第11卷第6期生物加工过程Vol 11 No 62013年11月Chinese journal of Bioprocess EngineeringNov.2013doi:10.3969jiss.1672-3678.2013.06.001海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件夏天虹,翁焕新(浙江大学环境与生物地球化学研究所,杭州310027)摘要:针对海带的碳水化合物不易被单一菌株发酵转化为乙醇的难题,通过酸化、匀浆和消化等预处理和正交试验,利用多酶系多菌种微生物复合发酵剂的酿酒曲,研究海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件。结果表明:在预处理试验中,加入一定量的Na2CO3,可以提高海带液中还原性糖和总糖的含量;消化温度对总糖影响相对较大,而对还原性糖的影响较小;过滤不利于得到较高浓度的乙醇;在优化条件中,发酵液的初始酸碱度是最重要的,其次是发酵温度和基质浓度,发酵液体积的影响程度相对较小。在基质(海带)质量浓度为0.15gL、溫度34℃、起始pH6.5和发酵液体积200mL时,可以获得最大的乙醇产量4.09g(以100g海带计)。关键词:生物乙醇;发酵;海带中图分类号:TQ517文献标志码:A文章编号:1672-3678(2013)06-0001-0The influencing factors and optimization of ethanoproduction from kelp fermentationXIA Tianhong WENG HuanxinInstitute of Environment Biogeochemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)Abstract: Kelp( Laminaria japonica)was acidified, homogenized, or digested, and then added into brothof Angel Distillers yeast for further fermentation. The influencing factors were determined and optimizedThe results showed that, the content of reducing sugar and total sugar could be increased by addingNa,CO, during pretreatment. The digestion temperature had more effect to the total sugar content than thereducing sugar content Filtration raised concentration of ethanol. Among the factors affecting the ethanolproduction, the initial pH of fermentation was the most remarkable one, and fermentation temperature andinitial kelp concentration came second. When the initial kelp concentration was 0. 15 g/L, thefermentation temperature 34C, the initial pH 6. 5 and the volume of fermentation was 200 mL, themaximum ethanol concentration was reached, with the equivalent of 4.09 g ethanol per 100 g kelp. Thisyork provides scientifie basis and technical support for finding an operational path in ethanol productionfrom kelp fermentationKey words: ethanol; fermentation; kelp生物乙醇是一种理想的可再生生物能源,它可土地资源,也不使用化肥和淡水资源,且产量高。以从不同的生物质原料中制取。海带生长不依靠在众多的生物能源原料中,海带具有明显优势,被收稿日期:2012-10-20基金项目:国家自然科学基金(40873058)者简介:夏天虹(1987—),女,四川宜宾人,硕士研究生,研究方向:生物质乙醇;翁焕新(联系人)教授Emal:gswenghx@iju,edu.cn生物加工过程第11卷认为是典型的第三代生物能源原料。利用海带消化法作为后续发酵的前处理,并通过正交试验,制备生物乙醇不仅可以避免能源与粮食的冲突,而分析各种影响因素,确定能够获得生物乙醇产量较且海带不含木质素,有利于海带制取乙醇的预处高的优化条件,以期为开发大型褐藻(海带)生物能理。另外,规模化种植海带一方面有利于沿海污染源提供科学依据和技术支撑海域生态环境的修复,另一方面藻类植物的光合作用可以固定空气中的CO2,减少温室气体的净排放。1材料与方法因此,大型海藻(海带)是提取生物乙醇最理想的原1.1材料料之海带( Laminaria japonica)购于市场。将海带试海带中的碳水化合物含量可达30%-50%34,样剪碎成小块,放入60℃的烘箱中千燥,至恒质量但其组成较复杂,多以多聚糖的形式存在,如褐后取出,经粉碎机粉碎至0.177~0.841mm,密封在藻酸和纤维素等,难以通过单一菌株使海带进行试样袋中待用。糖化同时发酵。因而依靠单一菌株发酵海带具酿酒曲:安琪酵母股份有限公司,属于多酶系有很大的局限性4-3。Lee等6研究发现,这个多菌种微生物复合发酵剂,主要含有酿酒酵母和根局限性可由不同微生物,即多种菌共同发酵来克霉菌服,也可通过基因工程的方法以达到高效制取12方法生物乙醇的目的。 Wargacki等通过基因工程1.2.1预处理试验手段建立了一个可同时降解、摄取以及代谢海藻海带的碳水化合物组成测定见表1。从表1可酸钠的微生物平台,利用此系统,海带糖分转化知:6种碳水化合物占被试海带干质量的51.32%为乙醇可达最大理论产值的80%。但是,这是一其中褐藻酸所占比例最大,达到30.52%,其次是甘个非常复杂的综合工艺,工业化实施过程存在较露醇和粗纤维,分别为12.27%和5.43%,能被发酵大困难。我国的酿酒历史悠久,酿酒曲能够提供菌直接利用的淀粉和还原性糖不到2%。由此可丰富的发酵菌种和酶系,有利于海带的糖化和见海带不利于直接发酵,通过预处理可以提高初发酵同时进行。始发酵液中的还原性糖和总糖含量。为了确定合为了探索相对简便且可行的海带制取生物乙适的预处理方式进行方法的选择试验和影响因素醇的工艺路径,笔者对比了几种预处理方法,选择试验。表1海带的碳水化合物组成Table 1 Components of carbohydrate in the kelp成分褐藻酸甘露醇海带淀粉粗纤维褐藻糖胶还原性糖含量/%12.275.430.241)预处理方法的选择试验。称取1.5g粉碎海1.5g粉碎海带于搅拌机中,加去离子水100mL,经带于250mL烧杯中,加100mL去离子水,在不同条1min处理后制备为匀浆,分别加入Na2CO30.3、件下进行预处理试验:①将试样直接放入65℃恒温0.60.9、1.2和1.5g,放置于65℃的恒温水浴中水浴中加温消化;②用2mmol/LHCl调海带液pH加温Ih,分别测定还原性糖和总糖含量。至2,在65℃恒温水浴中加温消化;③海带液经搅3)消化时间和温度的影响试验。称取1.5g粉拌机Ⅰmin处理后制备为匀浆,放入65℃恒温水浴碎海带于搅拌机中,加去离子水100mL,1min匀中加温消化;④匀浆后直接放置于常温消化;⑤加浆,再加入0.6gNa2CO3制备成一个取样时间的试入0.6gNa2CO3后放置于室温下消化;⑥海带液经样,一组(6个试样)放入65℃恒温水浴中加温消匀浆后加0.6gNa2CO3,在65℃恒温水浴中加温消化,另一组(6个试样)放置于室温消化,分别消化化。以上每种处理的消化时间均为1h,然后分别测0、15、30、45、60和90min后取样,测定还原性糖和定还原性糖和总糖的含量。总糖的含量。2)Na2CO3含量对消化反应的影响试验。称取4)过滤对发酵的影响试验。称量15g粉碎海第6期夏天虹等:海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件带,加1500mL去离子水,制备为匀浆放入382结果与讨论Na2CO3后于65℃恒温水浴1h。预处理后的海带液分成2组,一组为原始海带液,另一组海带液经42.1Na2CO提高还原性糖和总糖的作用层纱布过滤,两者分别调pH至6.5后,量取150ml图1显示了经过不同预处理后海带液中总糖和于250mL锥形瓶中,121℃下灭菌20min,冷却至还原性糖的含量变化。从图1可知:将海带颗粒在常温后加入0.2g酿酒曲,用厌氧塞封口,在30℃65℃恒温水浴中进行加温1h或经过酸处理,溶出下,100r/min恒温振荡器中培养,在不同的时间内的还原性糖和总糖虽然都略有增加,但不如直接将取液,分别测定还原性糖、总糖和乙醇的含量。试样制备成匀浆效果明显,这表明通过匀浆处理可1.2.2发酵试验以破坏海带组织结构,使部分糖分溶出。在匀浆中将海带经过匀浆后,每克添加0.2gNa2CO3于加入Na2CO3,并在65℃下恒温加热消化,可以获得65℃恒温水浴中进行预处理1h。然后用2moL较高的还原性糖和总糖,分别为668和13667mgHCl调节海带液pH,量取至250mL锥形瓶中,放入(以1g海带计)。这是由于褐藻胶是海带细胞壁的121℃灭菌锅中灭菌20min,取出后放置于无菌操重要组成部分,且Na2CO3可以与褐藻酸钙盐(褐藻作台待冷却每150m海带液中加入0.2g酿酒胶在海带中的主要存在状态)发生消化反应,使曲,用厌氧塞密封锥形瓶,于100r/min恒温振荡器海带细胞膨胀而破坏,结果导致海带中的糖分溶中培养。选择基质(预处理后的海带)质量浓度、发出,从而使溶液中还原性糖和总糖浓度提高。酵温度、灭菌前起始p和发酵液体积4个因子,进行正交试验L16(4),因子水平见表2。发酵160h,还原性糖18总糖测定乙醇的浓度值。02040508101214180表2L5(4“)正交设计因子水Table 2 Factors and levels of L1 (4 )orthogonal design2因子水平温度颗粒酸处理匀浆消化1消化2消化3初始V(发酵液)/(基质)处理方法颗粒65℃恒温水浴;酸处理一pH=2,65℃恒温水浴;6.5750.075匀浆一匀浆后65℃恒温水浴;消化1一常温下加Na2CO3;25.51000.10消化2-匀浆后常温条件;消化3-匀浆后加Na2CO365℃恒温水浴4.5图1不同处理海带液中还原性糖和总糖含量0.150Fig. 1 Content of reducing sugar and total sugarin the extract after different treatments1.2.3试样分析1)还原性糖和总糖测定。反应液的pH调至图1左上角小图显示了消化液中还原性糖和总6~9后,取10mL于离心管中,400r/min离心15糖含量随Na2CO3添加量的变化。可以看到,当min,取上清液。还原性糖用3,5-二硝基水杨酸比Na2CO3的添加量逐渐增大时(0~0.3g),消化液中色法测定;总糖用苯酚-H2SO4比色法测定。还原性糖和总糖浓度快速上升,当添加量为0.3g2)乙醇测定。取50mL发酵液于250mL圆底时,还原性糖和总糖质量浓度分别达到0.093和烧瓶中,加入50mL去离子水和几颗玻璃珠,装好蒸2.08mgmL。当Na2CO3的添加量从0.3g增加到馏装置,用50mL容量瓶接收(外用冰水浴),小火0.6g时,消化液中的还原性糖和总糖浓度略有增加热蒸馏至接近刻度50mL,定容、摇匀。取10mL加,然后随着Na2CO3添加量继续增加,消化液中的H2SO4和10mLK2Cr2O1(1:1)于50mL容量瓶中,还原性糖和总糖浓度不再增加,这表明了此时消化冷却后加入25mL蒸馏液,定容后混匀,放置10反应破坏海带细胞壁已饱和。季仲强“研究发现,min,在594m下测定吸光度2-13。重复试样的分增加NaCO3会加大消化液中的盐度,尽管酿酒酵母析误差小于5%。能耐受一定的盐度,对乙醇产率影响不大4,然而生物加工过程11高盐溶液对微生物具有毒害和抑制作用。因此,力(0,当发酵一段时间后,其转化的还原性糖大于选择Na2CO3的添加量为0.3g(相当于0.2g/g干海发酵消耗的还原性糖,还原性糖浓度开始上升,随带)时,可以较大限度地破坏海带细胞壁,从而获得着发酵的进行,还原性糖浓度持续下降较大的还原性糖和总糖含量,同时盐度相对较低。2.2时间和温度对消化反应的影响14图2显示了海带液中还原性糖和总糖含量随消未过滤还原性糖化时间的变化。由图2可知:消化液中还原性糖和◆未过滤总糖过滤还原性糖总糖的含量开始时随时间的增加而逐渐增加,而后过滤总糖随着消化时间的延长有下降的趋势。如常温下消化反应的总糖在30min时达到最大值1.44020406080100120140160180200时间hmg/mL,而还原性糖在45min时达到0.099mg/mL(a)过滤前后糖含量的变化的最大值,随着反应的进行,总糖和还原性糖的含量均开始下降;65℃下消化时,还原性糖和总糖的0.25020日过滤■未过滤增加速率比常温下消化要快,在30min时达到还原0.15性糖的最大值,之后缓慢下降,总糖在60min时达到最大值后下降。消化温度对还原性糖浓度影响005相对较小,在45min时,65℃和常温下的还原性糖浓度值相差较小;温度对总糖浓度影响比对还原性01224406488112136160184时间h糖浓度影响大,65℃下的消化效果明显优于常温消(b)过滤前后乙醇产量的变化化,在65℃下消化60mn时,总糖量达到最大值图3海带液过滤与未过滤处理后的发酵情况(2.058mg/mL)。Fig 3 Results of fermentation after kelp liquid with andwithout filtration and no treatment发酵初期主要由酿酒酵母直接利用易发酵的E原始还原性糖作为发酵底物,因此过滤海带液和未过滤海带液发酵产生的乙醇含量接近(图3(b))。008常温还原性糖亠65℃还原性糖但随着发酵的进行,乙醇的产生需要根据根霉的水0153045607590解和糖化能力。酿酒曲中微生物的作用与底料浓时间min度有密切关系,在一定范围内,微生物生长量和酶图2消化时间对还原性糖和总糖含量的影响反应速度均随着底料浓度的增加而成正比的增大。Fig 2 Effects of digesting time on reducing sugar and由于未过滤的海带液底料浓度比过滤的高,因此,total sugar contents with digesting time未过滤海带液中的徵生物生长量大,酶浓度高,代谢快,还原性糖消耗快,产生更多乙醇。在40h时2.3过滤对发酵影响后,过滤的海带液的乙醇含量几乎保持不变,而未图3显示了海带液过滤前后发酵情况。从图3经过过滤的海带液发酵的乙醇浓度则继续增加,并(a)可以看到,经灭菌后的未过滤海带液总糖比过在160h达到最大值0.232mL/L滤的总糖质量浓度大0.2mg/mL,在之后的发酵过褐藻胶黏性较大,4层纱布过滤海带液可将大程中,总糖含量下降,到24h后,由于酿酒曲中多种多褐藻胶及相应的纤维素去除。酿酒曲中含多种微生物共同作用,与褐藻胶紧密结合的碳水化合物酶及微生物,在发酵的过程中,主要成分的微生物溶于溶液中,总糖含量明显增加,而后持续下降。根霉可产纤维素酶,能利用转化海带中的纤维素。经灭菌后,过滤海带液和未过滤海带液的还原性糖因此,未过滤的海带液能进一步利用纤维素发酵得含量无明显差别,这表明过滤对还原性糖的初始值到较高的乙醇浓度。这个实验结果表明,过滤不利影响不大。由于根霉菌具有较强的糖化力和液化于发酵得到较高的乙醇浓度。第6期夏天虹等海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件2.4最佳发酵条件的确定间呈现出不同的变化趋势,其中,9号试验产生的乙采取添加0.2gNa2CO3于65℃恒温水浴中1h醇体积浓度最大,在160h时达0.7285mL/L,相当的预处理,不过滤直接进入优化条件试验。为了确于100g千海带产3.84g乙醇;其次是试验10,在定最优化的发酵条件,选择发酵温度初始pH、发酵4h时乙醇体积浓度为06308mLL(100g千海液体积和基质浓度4个基本参数,作为控制因子进带产3.99g乙醇),特别是试验13,虽然在112h时行海带发酵的正交试验。表3列出了各正交试验的达到的最大乙醇体积浓度为0.5372mL/L,没有试乙醇含量。验9和试验10那样高,但是却获得了全部试验的最从表3可以看出,各正交试验组乙醇含量随时大产率:100g干海带可产425g乙醇。表3正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experimentφ(乙醇)(mL·L1)试验号64h88h112h160 h0.02820.05650.06580.09410.075320.09410.07520.12230.15060.13170.15060.07530.10430.13320.12160.12160.12740.02890.04050.04630.06370.06950.15060.37500.35360.10880.03260.03260.038156780000000.47330.48400.43520.41340.47870.51140.12430.33500.25940.35660.33500.29720.01620.02700.03780.07560.10270.07560.49260.18620.13220.28840.48660.72850.63080.40250.28840.34240.21630.24031100.23100.10730.04830.03220.01610.010700.01610.00540.00540.00540.005400.45330.14550.53720.49240.50360.34100.25180.17350.17900.23500.212600.30060.43110.47070.50480.41400.31760.01700.04530.03970.03970.02830.0510表4列出了各正交试验乙醇最大含量的极差分内,最优的发酵条件:34℃初始pH6.5、发酵液体析结果,表4给出的数据显示,对于温度因素,第3积200mL和基质质量浓度0.15g/L水平34℃的T值为16225,明显大于该因素的其在温度、初始pH发酵液和基质浓度4个因子他水平值;对比初始pH一列的各T值大小,可以确中,极差(R)大小的排序:初始pH(R=0.3519)、温定该因素的最佳水平为初始pH=6.5(T1=度(R=0.2712)、基质浓度(R=0.2656)、发酵液1.7437);同理,分别对比发酵液和基质浓度的T(R=0.1947)。从R值的这个排序可知:在海带制值,可得到发酵液为第4水平200mL时(T4=取乙醇发酵过程的各影响因素中,发酵液的初始酸16754)以及基质浓度为第4水平的0.15g/L时碱度是最重要的,其次是发酵温度和基质浓度,来(74=1.8953)效果最佳。这表明,在此试验范围发酵液体积的影响程度相对较小。第1l卷表4酿酒曲正交试验各组乙醇最大含量的极差分析Table 4 Range analysis of the maximum ethanol content by Angel Distiller's yeastin different groups of orthogonal experiments试验号温度初始pHY(发酵液)/(基质)/q(乙醇)(g·L-)(mL L15.51000.15064.50.13322.50.1500.15060.1250.37505.50.1500.51142000.0750.35662.50.10271500.1500.72855.50.1250.6308750.1000.23100.0750.03226.50.1000.53725.51500.0750.34104.50.1500.5048162.50.051070.53741.74370.89640.8326721.06241.02l01.62251.22561.30491.1902T.1.43400.33581.6754K0.13440.43590.22410.2082K0.33630.40850.26560.25520.40560.30640.32620.2975KKR0.35850.08400.41880.47380.27120.35190.2656注:T为各因素第i个水平试验指标之和;K为各因素第i个水平试验指标的平均数;R极差值F检验结果也表明(表5),在显著水平为0025制取乙醇试验,图4显示了用基质质量浓度为0.15时初始pH、温度及基质浓度对乙醇含量影响显著,g/L的发酵液200mL,以初始pH为6.5和34℃下而发酵液体积对乙醇含量影响不显著;当显著性水进行发酵制取乙醇的情况,从图4可知:发酵进行平为005时,这4个因子对乙醇生产浓度的影响都24h时,乙醇体积浓度达到最大值,为0.7873mL/L比较显著。如果除去酿酒曲自身产出的乙醇,这时,乙醇的产根据正交试验确定的最佳条件,进行海带发酵率相当于4.09g乙醇(以100g海带计)。以海带批第6期夏天虹等:海带发醉制取生物乙醇的影响因素与优化条件发价3元/kg,乙醇7500元/t四计算,本文的乙醇从而使还原性糖大于其发酵的消耗量。随着发酵产值仍低于生产成本,但可结合褐藻胶和生物碘的时间的延长,还原性糖浓度逐渐下降。提取共同开发以降低成本和增加产值。随着发酵时间的延长,乙醇的浓度迅速降低,当60h后,乙醇10r-0酿酒曲酿消曲一还原性糖酸酒曲一总糖酿酒曲+海带三30但带,细酒能体积浓度在0.1~0.2mL/L之间波动。乙醇浓度在发酵24h达到峰值后开始下降,说明酵母开始消耗乙醇,一般只有当糖类质量浓度下降至4mg/L时N才出现这种情况,但此临界浓度随酵母菌种、培养条件等不同而有所不同。实验中海带基质浓度53045607590105120135150165很低是峰值乙醇浓度值不高的最主要原因,可考虑时间/h液化降黏和补料措施提高乙醇浓度,并维持较高图4优化条件的发酵情况浓度。Fig 4 Fermentation under the optimum conditions表5发酵正交试验方差分析Table 5 Analysis of variance of orthogonal experiments 3 s te方差来源偏差平方和自由度方差估计值F在预处理试验中,向海带液中加入一定量的0.17210.057420.7169Na2CO3,可明显地提高消化液中的还原性糖和总糖初始p0.30630.102236.9065浓度,且适宜的Na2CO3剂量为03g。预处理时间发酵液体积0.085830.028610.3286和温度会影响海带的消化反应影响总糖和还原糖基质浓度0.161430.053819.4284的溶出。消化温度对还原性糖的含量影响较小,而误差0.0083对总糖含量的影响较大,65℃条件下的消化效果明总和0.734215显优于常温消化。65℃条件下,预处理60min时,还原性糖和总糖相对较高。海带液经过滤后总糖Fa5(3,3)=15.44Fas(3,3)=9.28含量相应降低,未过滤的海带液发酵产生的乙醇浓度明显高于过滤液产生的乙醇浓度。图4右上角小图显示了酿酒曲与海带+酿酒曲对于消化预处理酿酒曲发酵海带制取生物乙醇的总糖和还原性糖随发酵时间的变化。从图4右上的最佳条件温度34℃初始pH6.5发酵液体积为角小图中可以看到发酵剂酿酒曲中的还原性糖和200m和基质质量浓度0.15g/L。在显著性水平为总糖的起始质量浓度分别为0.0177和0.17640.05时,发酵基质浓度、发酵恒温培养温度、灭菌前起mgm,随着发酵的进行,还原性糖和总糖浓度快速始pH和发酵液体积4个因子对乙醇含量的影响都比下降到较低水平,对海带制取乙醇的贡献值不大较显著,其中,发酵液的初始酸碱度是最重要的,其次在海带+酿酒曲中,还原性糖和总糖的起始质量浓是发酵温度和基质浓度,发酵液体积的影响程度相对度分别为0075和23mg/mL,在0-24h的发酵较小。在优化条件下海带发酵24h时可得到最大时间内,总糖浓度上升,随着发酵时间的延长,总糖乙醇含量产量409g(以100g海带计)。浓度逐渐减少,但发酵进行到64~112h时,总糖浓度再次上升,此时,发酵液从原来的稠黏状转变为参考文献:了半流体状液体,p也明显下降,这可能是随着发(1]chcs, Lee K T. A visionary and conceptual macroalge-based酵的进行,原黏附在褐藻胶上的糖分进入发酵液third-generation bioethanol( TGB) biorefinery in Sabah, Malaysia中,反映了发酵液的环境因素对总糖浓度产生的影as an underlay for renewable and sustainable development[J]响。在发酵0~24h时,还原性糖浓度明显上升,这Renew Sustain Energy Rev, 2010, 14(2): 842-848一方面是由于酿酒曲中含有还原性糖,在加菌的同21pa1,mJW,ms1, et al. Production of hydrogen from时增加了发酵液的还原性糖,另一方面是酿酒曲中narine macro-algae biomass using anaerobic sewage sludgemicroflora[ J]. Biotechnol Bioprocess Eng, 2009, 14(3): 307-315根霉菌的糖化作用,将溶液中的多糖转化为单糖,[3]纪明侯,张燕霞我国经济褐藻的化学成分研究:各种经济褐生物加工过程第11卷藻的主要成分[海洋与湖沼,1962,4(3/4):161168[11]郡雪岭,毛歆,郭一清.生物化学与分子生物学实验指导[4]季仲强近岸海域氮磷污染生态修复与大型海藻生物能源提[M].武汉:武汉大学出版社,2003:159160.取研究[D].杭州:浙江大学,2011.[12]魏冬梅张艳芳,张予林利用比色法测定葡萄酒的酒精度[5]张志奇翁焕新海带发酵生产乙醇及其影响因素的控制研[J].食品工业,2001(4):4546究[J]能源工程,2006(6):915[13]马美范,王君高比色法测定酱油中乙醇含量[].中国调味[6] Lee S M, Lee J H. The isolation and characterization of品,1994(7)simultaneous saccharification and fermentation microorganism for[14]陈正霖高金诚王学良褐藻胶[M]青岛:中国海洋大学出Laminaria japonica utilization[ J]. Bioresour Technol, 2011, 102版社,1989:707159625967[15] Vyrides I, Stuckey D C. Effect of fluctuations in salinity on[7] Wargacki A J, Leonard E, Win M N,etanaerobic biomass and production of soluble microbial productsmicrobial platform for direct biofuel production from brown(SMPs)[J].Biodegradation, 2009, 20(2): 165-175macroalgae[ J]. Science, 2012, 335(6066): 308-313.[16]谢邦祥,农家小曲酒酿造实用技术[M],北京:金盾出版社[8]徐颖宣徐尔尼,冯乃宪等微生物混菌发酵应用研究进展2003:21「J].中国酿造,2008(9):1417]中国化工网乙醇市场价格保持坚挺走势[EB/OL].[20120[9]纪明侯海藻化学M].北京科学出版社,1997:20835423.http:/news.chemnet.com/item/2011-02-23/1506887.html[10]张彩莹肖连冬.生物化学实验M].北京:化学工业出版社,[18]于景芝陈尧榮俞学锋酵母生产与应用手册M].北京:中2009:21-23国轻工业出版社,2005:45