玉米秸秆制备燃料乙醇的集成技术研究

第33卷第5期林产化学与工业Vol 33 No 52013年10月Chemistry and Industry of Forest ProductsOct.2013di:10.3969/j.isn.0253-2417.2013.05.004玉米秸秆制备燃料乙醇的集成技术研究储秋露,杨德良,马斌,勇强(南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)摘要:175g蒸汽爆破玉米秸秆在底物质量浓度100gL,纤维素酶用量20FUg(以纤维素计)、β-葡萄糖苷酶用量3πU/g(以纤维素计)下酶解48h,酶解得率为74.89%;酶解液经固液分离,上清液浓縮用于髙糖浓淸液发酵,葡萄糖利用率为99.56%,乙醇得率为理论得率的94.50%;CHU Oiu-lu474.3g酶解渣经酿酒酵母于酵母用量为每克酶解渣2.0×10°个/克、30℃下固态发酵24h再变温至36℃发酵42h,反应体系中乙醇质量为1.59g。175g蒸汽爆破玉米秸秆经低底物浓度水解、高浓清液发酵、酶解渣固态变温发酵过程获得36.49g醇,乙醇转化率为θ.209g/g(以蒸汽爆破玉米秸秆计)。关键词:玉米秸秆;酶解渣;固态变温发酵;集成技术中图分类号:TQ35文献标识码:A文章编号:0253-2417(2013)05-0020-05Integrated Process of ethanol production from Corn stoverCHU Qiu-lu, YANG De-liang, MA Bin, YONG QiangCollege of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)Abstract: When the steam exploded corn stover was hydrolyzed by cellulase at substrate loading of 100 g/L and cellulase dosageof 20 FPIU/ g-cellulose, B-glucosidase dosage of 31U/g-cellulose for 48 h, the hydrolysis yield was 74. 89 % Following solidliquid separation, a liquid fermentation of concentrated supernatant was performed, the glucose consumption yield and ethanolyield were 99. 56 and 94. 50 % respectively. Variable temperature fermentation of enzymatic hydrolysis residue was carrieout at yeast loading of 2.0 x 10 cfu/g enzymatic hydrolysis residue, applying 30 C for the first 24 h and 36 C for the next 42 h.It was found that 11. 59 g ethanol was obtained from 474. 3 g enzymatic hydrolysis residue. 175 g steam exploded corn stover wasbio-refinied through the intergrated processes containing lower substrate hydrolysis, higher glucose concentration fermentation andvariable temperature fermentation of enzymatic hydrolysis residue process. Finally, 36. 49 g ethanol was obtained, and thepretreated corn stover-to-ethanol conversion yield was 0. 209 g/gKey words: corn stover; enzymatic hydrolysis residue; two-stage solid state fermentation; integrated process随着全球资源、能源、环境问题的突出和全球气候变暖趋势的加强,寻找清洁、可再生能源成为人类的必由之路,其中燃料乙醇凭借独特的优势成为首选之一。植物纤维原料生物法制取乙醇的关键技术主要包括原料预处理、纤维素酶制备、纤维素水解、糖液发酵,其中纤维素水解、糖液发酵技术是影响乙醇生产成本的关键因素之一。目前研究较多的纤维素水解、糖液发酵技术主要包括以下3种:1)低底物浓度纤维素水解、清液乙醇发酵。该工艺纤维素水解结朿固液分离后有一部分糖残留于酶解渣中,需耗用大量水洗涤,得到的糖液较稀,需消耗大量的蒸汽进行浓缩;如果水解结束固液分离的酶解渣不水洗回收糖则导致糖的损失;2)高底物浓度纤维素水解、带渣乙醇发酵,该法存在以下缺点:高底物浓度水解产生的终产物抑制作用降低了纤维素酶水解的得率,并且底物浓度受酶水解得率和工业应用的限制,很难超过30%;高底物浓度下的酶解、发酵需要搅拌,能耗高;带渣发酵的酵母不能循环利用;3)纤维素同步糖化发酵,该工艺存在的缺点是纤维素的酶水解和酵母乙醇发酵的温度不一致,影响了纤维收稿日期:2012-10-26基金项目:国际先进林业技术引进项目(2012-4-18);国家自然科学基金项目(31中国煤化工科研创新计划(CXZZ1-0527)CNMHG作者简介:储秋露(1986-),女,江苏宜兴人,博士生,主要从事生物质资源生物转化的硎究*通讯作者:勇强,教授,博士生导师,主要从事生物质资源生物降解与转化的研究;E-mail:swhx@njfu,com.cn第5期储秋露,等:玉米秸秆制备燃料乙醇的集成技术研究素的酶水解过程和乙醇发酵过程,从而限制了该法在工业上的应用。综上所述,从生产成本角度出发,目前研究的主要几种植物纤维原料纤维素酶水解、糖液发酵工艺均存在着一些问题,有待于进一步优化。本研究探讨了玉米秸秆制取燃料乙醇的集成技术,包括低底物浓度酶水解,高糖浓清液发酵和酶解渣固态变温发酵,可为提高纤维素乙醇生产效率、降低纤维素生物炼制燃料乙醇的成本提供依据。1实验1.1菌种酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)NLH3,乙醇发酵菌株,于4℃保存在葡萄糖琼脂斜面培养基上,由南京林业大学生物化工研究所保存。1.2纤维素酶和B-葡萄糖苷酶纤维素酶购于 Sigma公司滤纸酶活力l02FPUg,B-葡萄糖苷酶活力2.50U/g;β-葡萄糖苷酶,购于 Sigma公司,B-葡萄糖苷酶酶活力504IU/g1.3原料预处理玉*秸秆粉碎至3-5cm,在3.5L蒸汽爆破装置中于1.5~2.2MPa、停留时间2-6min下进行预处理。预处理后的物料用蒸馏水(总料液比1:10(g:mL))分3次洗涤、抽滤后得到的滤渣,即为蒸汽爆破玉米秸秆。蒸汽爆破玉米秸秆储存于密封袋中,于4℃冰箱中平衡水分2d,备用。蒸汽爆破玉米秸秆中含水分60.68%,纤维素47.60%(以干基计)。14蒸汽爆破玉米秸秆制备乙醇的集成技术1.4.1纤维素酶水解175g1.3节蒸汽爆破玉米秸秆于底物质量浓度100g/L、纤维素酶用量20FPIU/g(以纤维素为基准,下同)、B-葡萄糖苷酶用量3U/gpH值48、50℃条件下经纤维素酶水解48h,水解结束后于4000r/min条件下离心10min,上清液即为玉米秸秆酶水解液,沉淀为酶解渣,备用。平均酶水解反应速率(g/(Lh))和酶解得率(以蒸汽爆破玉米秸秆计)计算如下平均酶水解反应速率=(纤维二糖质量浓度+葡萄糖质量浓度)/反应时间酶解得率=(纤维二糖质量×0.95+葡萄糖质量x0.9)/(175×(1-0.607))×100%1.42高糖浓清液发酵玉米秸秆酶水解液经70℃,0.016MPa减压蒸发浓缩至葡萄糖质量浓度为180-250g/L后即为高糖浓清液进而进行发酵。取50mL高糖液清液于250mL锥形瓶中,加人适量酵母和营养盐(0.08g/ L MgSO4,0.08g/ L ZnCl2,0.20g/ L CaCI2和0.24g/L尿素),于30℃、100r/min条件下发酵24h。每4h取样于10000r/min下离心5min,取上清液测定葡萄糖和乙醇浓度。糖利用率和乙醇得率计算如下糖利用率〓发酵液中消耗葡萄糖质量/初始葡萄糖质量×100%乙醇得率=发酵液中乙醇质量/(消耗葡萄糖质量×0.51)×100%1.4.3酶解渣固态变温发酵474.3g1.4.1节的酶解渣于500mL圆底烧瓶中,加人适量酵母和营养盐溶液(10g/ L CacI2、4g/ L MgSO4和4g/ L Zncl2),于30℃、100r/min条件下发酵24h后变温至36℃再发酵42h,并取样于10000r/min下离心5min,取上清液测定葡萄糖和乙醇浓度。发酵结束后在发酵醪中加适量蒸馏水,用玻璃棒充分搅拌后于10000y/min下离心5min,取上清液测定葡萄糖和乙醇浓度。酶解、发酵集成过程的乙醇转化率(g/g)计算如下乙醇转化率=(清液发酵乙醇质量+固态发酵乙醇质量)蒸汽爆破玉米秸秆质量×100%5分析方法5.1原料测定原料中纤维素、戊聚糖和木质素等含量的分析均按照美国国家可再生能源实验室(NREL)所推荐的方法(。1.5.2纤维素酶活力的测定滤纸酶活力的测定采用国际理论方法测定3。一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmdl葡力的测定采用对硝基苯基-B-D-葡萄糖苷(pNPG)试剂方法测定。H中国煤化工推荐的标准CNMHG糖苷酶酶活用循日興酬活力单位定义为每分钟生成Iμmol对硝基苯酚所需要的酶量。林产化学与工业第33卷1.5.3纤维二糖、葡萄糖和乙醇浓度测定采用高效液相色谱( Agilent1200)分析,外标法测定。色谱条件:Bio- Rad Aminex HPX-87H色谱柱(78mm×300mm),进样量10μL;流动相0.005moLH2SO4,流速06mL/min,柱温55℃,示差折光检测器检测。2结果与分析802.1蒸汽爆破玉米秸秆制取乙醇集成技术研究2.1.1蒸汽爆破玉米秸秆的酶水解蒸汽爆破玉米秸秆在底物质量浓度100g/L,纤维素酶用量20FPU/gB-葡萄糖苷酶用量3U/g下水解48h其历程如图1所示。由图1可知,经过48h的酶水解,酶解体系中081624324048的葡萄糖质量浓度为36.67g/L,酶解得率为时间h74.89%,平均酶水解反应速率从2h的口-水解速率 hydrolysis rate;-O一酶解得率 hydrolysis yield△一葡萄糖质量浓度 glucose concentration6.21g/(Lh)下降至48h的0.82g/(L·h)。酶水解前期的水解速率较高,葡萄糖质量浓度快速上图1蒸汽爆破玉米秸秆的水解历程Fig. 1 The hydrolysis course of steam exploded corn升,酶水解得率迅速提高。而酶水解后期的水解速stover率较低,葡萄糖质量浓度缓慢上升,酶水解得率没有明显的提高,这可能是由于酶在木质素上的不可逆非生产性吸附和终产物抑制6造成的。此外,酶水解底物浓度是植物纤维原料制备乙醇的重要因素,低底物浓度下的酶水解得到了较高的酶解得率,为降低植物纤维原料制备燃料乙醇的原料成本提供了依据2.1.2酶解糖液的浓缩蒸汽爆破玉米秸表1浓缩前后糖液中可发酵性糖和抑制物的浓度秆酶水解液经70℃,0.016MPa减压蒸发浓Tabe1 The fermentable sugars and inhibitors co缩前后的可发酵性糖和抑制物的浓度如表1before and after concentration所示。糖液浓缩前浓编后before concentration after concentration由表可知经过浓缩的葡萄糖质量浓度葡萄糖ew(gu)35.53216.97达到216.97g/L,木糖质量浓度也有所上升。木糖 xylose/(g·L)减压蒸发浓缩能有效地脱除抑制物,尤其是甲mag0.320.680.32挥发性比较大的抑制物,如甲酸、乙酸和糠乙酰丙酸 levulinic acid(g·L)0.030.24醛,其脱除率分别为64.88%、34.40%和羟甲基榛醛/(g:L0.050.2836.25%。挥发性抑制物的脱除能降低抑制5-hydromethylfuraldehyde糠醛 furfural/(g·0.00.27物对后续己糖发酵的抑制作用,一定程度上提高浓缩糖液的可发酵性,提高乙醇产量2.1.3高糖浓清液发酵高糖浓清液发酵120历程见图2。由图可知酿酒酵母能够快速地将葡萄糖转化为乙醇。由于酵母的加入,发酵的初始葡萄糖质量浓度为19241g/L,发酵24h后残余葡萄糖质量浓度为0.84g/L,糖利用率为99.56%,乙醇质量浓度为92.33g/L,乙醇得率为理论得率的94.50%。48121620239mL清液发酵的乙醇产量为24.90g高时间h糖浓清液发酵得到了高乙醇质量浓度的发酵质量浓度 ass concn:中国煤化工醇ctha液,高乙醇质量浓度和高乙醇得率能有效降△-糖利用率goCNMHG低后续乙醇蒸馏的成本和减少纤维素乙醇的图2高糖浓清液发髒历程生产成本。Fig. 2 The fermentation course of concentrated supernatant第5期储秋露,等:玉米秸秆制备燃料乙醇的集成技术研究2.1.4酶解渣固态变温发酵历程酿酒酵母在酵母用量2×10°个/g(以酶解渣计)下对酶解渣固态变温发酵的历程如图3。175g蒸汽爆破玉米秸秆经纤维素糖化、固液分离后得到474.3g酶解渣,酶解渣中纤维素含量22.71%,葡萄糖含量12.56g。由图3可知酶解渣固态变温发酵主要分为2个阶段,发酵前24h,酶解渣中游离葡萄糖被酿酒酵母快速发酵成乙醇、少量纤维素被同步糖化发酵成乙醇。由于反应体系中葡萄糖的存在,此阶段纤维素水解受到产物反馈抑制,30℃发酵24h,体系中葡萄糖质量降低到082g酶解渣中纤维素含量从初始的22.71%降低到20.02%,乙醇质量和集成过程乙醇转化率分别为7.70g和0.186g/g(以蒸汽爆破玉米秸秆计,下同)。酶解渣固态发酵24h后,将温度提高到36℃,随着反应时间的延长,尽管体系中葡萄糖质量浓度检测不到,但乙醇质量浓度持续增加,原因是酶解渣中残留的纤维素被吸附在酶解渣上的纤维素酶降解成葡萄糖后迅速被酵母发酵成乙醇。发酵66h,体系中乙醇质量达到159g,集成过程的乙醇转化率达到0.209g′g。第二段36℃发酵酶解渣中纤维素含量从20.92%下降至12.61%,且纤维素降解速率明显髙于第一段30℃发酵纤维素的降解速率。造成上述现象的原因是较高的温度和体系中葡萄糖对纤维素酶抑制作用的解除促进了酶解渣中纤维素的酶水解。对照组为酶解渣在30℃下的恒温固态发酵(见图3),发酵66h后,体系中乙醇质量为917g,乙醇转化率为0.195gg,乙醇产量和转化率均低于固态变温发酵。造成上述现象的原因是酶解渣固态发酵具有同步糖化发酵作用,而同步糖化发酵中酶最适反应温度和乙醇发酵温度不一致酶反应最适温度在50℃左右,酵母乙醇发酵适宜温度在30℃左右。0.240.22冬尔邮憋紫0.200.180.166t21824是b品0.14612182430364248546066时间h实验组smpi-■一糖 glucose;-▲-乙醇 cthanol,-·-乙醇得率 ethanol yield;-x-纤维素 cellulose对照组 control糖 glucose;-△-乙醇 ethano-o-乙醇得率 ethanol yield图3酶解潼固态变温发酵历程Fig 3 The solid state fermentation course of enzymatic hydrolysis residue综上,在酶解渣固态发酵过程中,变温发酵兼顾了酶解和发酵对温度的需求,第一段30℃发酵有利于游离葡萄糖的发酵和菌体的生长第二段36℃发酵更有利于酶解渣中纤维素的酶水解,促进了乙醇产量的进一步提高。2.2集成技术的优势玉米秸秆制备燃料乙醇集成技术中,纤维素在低底物浓度下糖化保证了较高的酶水解得率,高浓度糖液发酵获得的高乙醇浓度降低了后续乙醇蒸馏的成本,酶解渣固态变温发酵进一步提高了纤维素的转化率。集成技术既避免了低底物浓度酶解发酵分开进行工艺中酶解渣洗涤耗用大量水和能耗高的问题,又避免了高底物浓度酶解水解物直接发酵工艺中酶水解得率低、能耗高、不能实现高糖发酵和酵母回收循环利用的问题同时酶解渣的固体发酵具有同步糖化发酵的作用,进一步提高了纤维素的转化率。中国煤化工3结论CNMHG蒸汽爆破玉米秸秆的集成技术:175g经蒸汽爆破后的玉米秸秆,底物质量浓度100g/L下纤维素4林产化学与工业第33卷酶水解得率为74.89%;含192.41g/L葡萄糖的纤维素水解糖液乙醇发酵糖利用率为9.56%、乙醇得率为理论得率的94.50%,得到乙醇质量为24.90g;474.3g酶解渣经酿酒酵母固态变温发酵后,乙醇质量为11.59g。175g经蒸汽爆破后的玉米秸秆经低底物浓度水解、高浓度糖液发酵和酶解渣固态变温发酵过程获得乙醇36.49g,乙醇转化率为0.209gg(以蒸汽爆破玉米秸秆计)。参考文献[]董秀芹,吕惠生发展燃料乙醇产业是缓解能源危机的重要举措[].国际学术动态,2003(3):14-15[2 ]SLUITER A Biomass analysis technology team. laboratory analytical procedure[S]. 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