生物法拆分α-苯乙醇

第40卷第2期应用化工VoL 40 No. 22011年2月Applied Chemical IndustryFeb.2011生物法拆分α-苯乙醇李冬桂,马丽,刘雄民,蔡福宁(广西大学化学化工学院,广西南宁530004)要:从土壤中筛选出一株能高效选择性氧化(S)-(-)1苯乙醇的菌株了13,初步鉴定为草酸杆菌( Oxalobacteraceae即p.)。将其用于不对称氧化拆分消旋a-苯乙醇的反应。研究表明,菌株 oralobacteraceae即p.KI3适合的催化拆分条件为:碳源、氮源分别为糊精和蛋白胨发酵?2h,a苯乙醇质量浓度为4g/L反应体系初始pH=6,30℃反应72h在此条件下,(S)-(-)-1苯乙醇的转化率为9863%,(R)-(+)-1-苯乙醇对映体过量值ee98.01%。关键词:选择性催化;a苯乙醇;性拆分中图分类号:TQ033文献标识码:A文章编号:1671-3206(2011)02-0239-04Biological resolution of a-phenyl ethanolLI Dong-gui, MA Li, LIU Xiong-min, CAl Fu-ningSchool of Chemistry Chemical Engineering, Guangui University, Nanning 530004, China)Abstract: The strain JX13 which can catalyze the oxidation of (S)-(-)-l-phenyl ethanol selectively wasscreened from soil. It was identified as Oxalobacteraceae sp. The appropriate conditions for the reactionwere a-phenyl ethanol 4.0 g/L, pH =6.0, 30 C, reaction time 72 h, dextrin as carbon source and pep-tone as nitrogen source The conversion of (S)-(-)-1-phenyl ethanol and the enantiomeric excess of(R)-(+)-I-phenyl ethanol with strain JX13 were up to 98.63% and 98.01%, respectivelyKey words: selective catalysis; a-phenyl ethanol; chiral resolution含芳香基的光学活性醇是天然产物及手性药物贵。以微生物整体细胞代替酶进行外消旋芳合成中重要的手性中间体,手性醇的两个对映体基仲醇的氧化还原拆分,可以利用微生物活性细胞在手性药物合成中可用来创造最初的手性中心。生内的代谢过程使辅酶再生,免去了添加辅酶及氧化命体系对手性药物中不同构型的立体异构体会表现还原酶复杂且昂贵的分离过程,有利于保持细胞内出不同程度的生理效能23。因此人们更着眼于使氧化还原酶的催化活性。草酸杆菌能参与草酸用高光学纯度的单旋体作为特效药。代谢主要用于抑制尿结石的形成1。目前利目前,微生物细胞催化不对称还原潜手性酮和用草酸杆菌整体细胞氧化拆分a苯乙醇的方法尚生物法拆分手性醇是获得单一对映体手性醇的两种未见报道重要途径。利用酯酶或脂肪酶催化外消旋仲醇的对本研究采用了微生物细胞氧化法拆分a苯乙映选择性酯化或转酯化拆分及外消旋酯的对映选择醇筛选出一株能催化选择性氧化(S)(-)1苯乙性水解拆分是生物法拆分手性醇的一种方式,目醇为苯乙酮的菌株 Oxalobacteraceae s.D13,从而前已有较多文献报道。但转酯化拆分需先合成得到(R)(+)1苯乙醇,并对拆分反应条件进行了不对称酯,伴有副反应发生。利用氧化还原酶催化优化研究。的方法将外消旋芳基仲醇的一个对映体氧化为芳基1实验部分酮同样可以实现外消旋的芳基仲醇的拆分。这11试剂与仪器过程往往需要辅酶的参与,而这些辅酶非常昂a-苯乙醇(质量分数9%),优级纯;乙腈收稿日期:2010-1207修改稿日期:010-1214基金项目:广西应用基础研究专项资助项目(桂科基0832002);广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻109012)作者简介:李冬桂(1985-),女(瑶族),广西桂林人,广西大学在读硕士研究生师从马丽高级工程师从事香料化学方面的研究。电话0771-3270732E-mail:ldg1985@163.cm240应用化工第40卷为色谱纯;葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、K2HPO4、表1菌株的筛选MSO4·7H2O、FeSO47H2O、NaCl、KH2PO,琼脂等Tabl1 Microbes screened from so均为分析纯;土样采自南宁高峰林场肉桂种植林区菌株(S)-(-)-1苯乙醇转化率/%c/995.1893.23土壤。9.22525二元HPLC泵;2487UV/ⅥS检测器。17221.2培养基1.2.1平板培养基(g/L)葡萄糖20,蛋白胨由表1可知,有4株菌株可将a苯乙醇中的10,酵母膏2.5,K2HPO41.0,MsoO4TH1。O0.5,(s)、(-)1-苯乙醇选择性氧化为苯乙酮13'菌株FeSO4·7H2O0.01,NaCl0.5,琼脂20。可以获得较好的转化率和ee值,故选13‘菌株作为1.22斜面培养基(gL)KH2PO,3.0,琼脂25,实验菌株。其他试剂与平板培养基相同2.2菌株JX13的鉴定1.2.3富集培养基(g/L)葡萄糖20,蛋白胨l6 S rDNA PCR扩增和序列测定结果表明菌株10,酵母膏2.5,a苯乙醇0.5mL,K2HPO,L.O,了13为草酸杆菌( Oxalobacteraceae),把该菌株命名MgSO4·7H2O0.5,FesO4·7H2O0.01,NaC10.5。为 Oxalobacteraceae sp.巩X13。1.2.4初始发酵培养基除不含α-苯乙醇外,其2.3转化产物的分析鉴定他试剂与富集培养基相同。所有培养基均在120℃标准品和转化液HPLC液相分析谱图见图1灭菌20min。图13实验方法取5g土样于50mL富集培养基中,30℃培养3d。稀释涂布分离后,30℃培养3d。挑取单一菌落至斜面培养基上,30℃培养3d保存于4℃冰箱中备用。挑取斜面培养基上的菌种一环,接种于已灭菌装有100m发酵培养基的500mL锥形瓶中,30℃、180r/min培养3d加入0.2ga苯乙醇底物,30℃、180r/min转化3d,得到转化液。分别以底物中(S)-(-)-1-苯乙醇转化率和(R)-(+)-1-苯101112131415161718保留时间/min乙醇的对映体过量值(e)表示反应的程度和立体图1标准样品HPIC图选择性。Fig 1 HPLC chromatogram of standard sample1.4分析方法取转化液1mL于10mL容量瓶中,用流动相定容,将定容后样品转入干燥离心管中离心8min,取上层清液经0.45μm有机系微孔滤膜过滤后,用HPLC分析。HPLC分析条件:色谱柱为配有相应预柱(0.4cmx1cm)的0.46cmx15cm的 Chiralcel O手性柱( Daicel),流动相为v(乙腈):v(水)=1030:70,流速0.5mL/min,紫外检测波长205mm,进保留时间/min样量10μL。图2转化液HPLC图2结果与讨论Fig 2 HPLC chromatogram of sample1.(S)-(-)-苯乙醇;2.(R)-(+)-1-苯乙醇;3.苯乙酮2.1微生物的筛选由图1、图2可知,产物的保留时间与苯乙酮标对土样进行稀释涂布在平板上长出一些菌落,准样品的保留时间相同,Ⅸ13菌株有选择性的氧化经平板划线分离得到38株菌株。对38株菌株进行(S)-(-)-1-苯乙醇为苯乙酮,留下未反应的培养和反应,筛选结果见表1。R-(+)-1-苯乙醇,从而实现消旋苯乙醇的拆分。转第2李冬桂等:生物法拆分a苯乙41化反应式如下:Oralobacteraceae JX13racemIc-1·PEAR- PEA2.4培养条件对消旋苯乙醇拆分的影响氮源。24.1碳源的影响碳源对微生物的生长起着重2.5反应条件对消旋苯乙醇拆分的影响要的作用,在无碳源的发酵培养基中,分别等质量地2.5.1底物加入量影响通常芳香类化合物对活添加葡萄糖、乳糖、糊精、麦芽糖、淀粉、蔗糖碳源培性细胞具有一定的毒性,图5为底物质量浓度在养3d后,均加人0.2g/L的a苯乙醇底物反应16g/L时对a-苯乙醇拆分的影响3d,结果见图3120转化率「圈「门「0麦芽糖糊精葡萄糖蔗糖乳糖淀粉a-苯乙醇质量浓度/(g·L图3碳源种类对反应的影响图5a苯乙醇质量浓度对反应的影响Fig 3 Effects of carbon sources on the reactionFig 5 Effect of p(a-PEA)on the reaction由图3可知,以糊精、麦芽糖为碳源时。菌体生由图5可知,底物量在1~3g/L时,底物转化长好,底物的转化率和ee值都很高;以糊精为碳源率和ee值均达到了100%,当底物加人量为5时,底物的转化率和ee值达到了100%。因此,选6g/L时,底物转化率和e值有明显下降趋势。因择糊精作为培养基的适宜碳源此,选取底物加入量为4g/L做其他条件优化24.2氦源的影响氮是构成菌体成分和合成蛋2.5.2pH对α-苯乙醇拆分的影响pH的改变会白质和酶等的重要元素氮源主要分为有机氮源和引起酶活性的变化,过高或过低的pH会改变酶活无机氮源两类,当∝苯乙醇为02g/L时,改变初始性中心的构象,造成酶活性的降低。用不同pH的发酵培养基中的氮源组分,考察等质量加入硝酸铵、磷酸盐缓冲液调节反应体系的pH,考察pH对拆分硫酸铵、蛋白胨、玉米粉、酵母膏氮源对拆分的影响,a苯乙醇的影响结果见图6。结果见图4。□转化率6蛋白胨酵母膏硫酸铵硝酸铵玉米粉图4氮源种类对反应的影响图6pH对反应的影响Fig 6 Efect of pH on the reaction由图4可知,以蛋白胨和酵母膏为氮源较好,其由图6可知,pH在5~7时,底物转化率和e中以蛋白胨为氮源时,底物的转化率和e值达到值变化不大。因此,13·菌种拆分a苯乙醇适宜的了100%。因此,选择蛋白胨作为培养基的适宜pH范围是5~7242应用化工第40卷25.3温度对α-苯乙醇拆分的影响反应体系的pH=6,30℃反应72h,(S)-(-)-1-苯乙醇转化率温度会影响菌株的催化能力,实验考察了20~45℃可达98.63%,ee值达98.01%,实现了菌株范围内,反应温度对拆分反应的影响结果见图7。 Oxalobacteraceae sp.JK13对a苯乙醇的最佳拆分效参考文献:R, Paulo J S moraadvances in the biocatalytic asymmetric reduction of ace-tophenones and a, B-unsaturated carbonyl compouds[J]Food Technol Biotechnol, 2004, 42(4): 295-303[2]宫丽,卞俊手性药物的药理学立体选择性[打]国外医学药学分册,2007,34(2):123-126.温度饣[3]王丹,李亚手性药物及其开发与应用[J现代医药图7温度的影响卫生,2007,23(6):837838.Fig 7 Effect of temperature on the reaction[4]王普善王宇梅手性药物开发战略的再认识[刀]精由图7可知,在30℃时,转化率和ee值为最细与专用化学品,2004,12(10):48高,随着温度继续升高,转化率和e值均下降,[5]张中义,吴新侠脂肪酶在手性药物制备中的应l40℃时,基本无转化。这主要是因为温度过高,部[J].食品与药品,2007,9:4043.[6]严祥辉,薛屏.用壳聚糖修饰的MCM48固定化脂肪分氧化还原酶已失活。因此,选择30℃为适宜的转酶拆分(R,S)-1-苯乙醇[J].宁夏大学学报,2009,30化温度。(1):50542.5.4反应进程曲线在上述最优条件下,考察了[7]王晨王文凯陈华勇脂肪酶催化拆分1(4甲氧基1~5d菌株 Oxalobacteraceae sp.X13拆分α苯乙醇苯基)乙醇的研究[冂]现代食品科技,200,25(4)的反应进程,见图8。[8]王旭徐威游松微生物转化在药学中的应用[门]沈阳药科大学学报2006(23)7:4774829] Nie Y, Xu Y, Mu X Q.of racemic 1-phenyl-1, 2-ethanediol by stereoinmversion in-ing a novel cofactor-dependent oxidoreduction systemof candida parapsilosis CCTCC M203011[J]. 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