mRNA差异显示条件的优化

生物技术通讯LETTEHS IN BIOTECHNOLOGYVuL.I4 No.3 May, 2003191文章编号:1009 -00202002)03-0191-03研究报告mRNA差异显示条件的优化唐明娟'，郭顺星，申业，胡鸢雷2(1. 中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100094; .2.北京大学生命科学院蛋白质工程与植物基内工程国家重点实验室.北京100871)摘要:运用优化的mRNA差异显示技术分离受内生真菌诱导的差异基因。优化差异显示条件表现在增加锚定引物和随帆引物的长度、改变PCR参效和再扩增程序.运用策染显色等。应用这些条件共获得7个阳性差异片段。系来党化的PCR程席|前逸35条差异带,得到3个两端均为随机引物的差示片段。两用优化的PCR程序2, 52条差异带中得到9条只能用锚定引物和随机引物才能护增出的片段。地高辛标记的反向-Northem塞定为阳性后进行党隆和测乐、PCR方法!所得的3个差示片段均无开放的阅读框。PCR程序2得到7个差异表达的基囚中,2个为已知基因,5个为未知基因。因此可运用优化的差显技术分离差异表达的基因。关键词: mRNA 差异显示:聚合酶链式反应:镶染:反向-Northerm中團分类号: Q781文献标识码: AOptimization of mRNA differential displayTANG Ming -juan', GUO Shun- xing'，SHEN Ye, HU Yuan-lei2(1. Institute of Medieinl Plant, Chinese Acadeny of Medical Scienend Beijing Union Medical College, Bejjing 100094;2. Stale Key Laboraory of Prolein Engineering and Plant Molecular Biology, Peking University, Bejjng 100871, China)Abstract: Optinied mRNAs diferential display tehnique(D)) was used lo identify genes rgulaled by endopbytiefungi. By increasing the lengths of ancbored primer and random primner, modifying the provedures of PCR and re-amplification. und siver staining, seven positive dfferential fragments were obrained. In 35 PCR experinents (CRuetud 1), 3 dferentiall bands were ierifiede, which were amplied with abitary primes on both ends. While inPCR method 2.9 of 52 diferentiall bhands were re-umplied only wih arbinrary primer and random primer. Sequenceanalysis folowedl by revense-Northen blol wih DIG probed conimed prsitive difrentiall gene. The three difreretial genes had no ORF(open reading frane) in PCR metlod 1. Among seven difrnially expresed genes, two wereknown genes and five were unknown genes. So the optimized DD prolocol can bhe aplied to idenify difereniallyexpressed genes.Key words: mRNA dfferential display; PCR; silver staining; revese -NorthemmRNA差异显示(mRNA diferential display)是PCR参数重新改进后获得7个阳性片段。现将结果近年来发展起来的用于研究基因诱导后表达变化的报道如下。有效方法。因其操作简便、快速,一次能分析多个样品而成为分离新基因的首选方法。但是,假阳性率高1材料和方法和重复性低的缺陷又使得此项技术的应用受到一定程度的局限。为此,许多学者不断努力,从引物的设1.1 植物材料计.PCR循环参数、非放射性标记.鉴定阳性片段的.福建金线莲(A. roxburghii)组培 苗生长在1/2 MS 培养方法等方面进行改进和优化,取得了较好效果。本研基l0d后接人已活化的内生真菌AR-18川,25个光照下共培究果用前人所优化的条件未能获得阳性片段，而将苗养60 d收获。对照则为同样条件下不与内生菌培养的无菌收稿日期:2003- 01-091.中国煤化工基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270148):商等学校全国"wA .H-TdG、H-TC优秀博+:学位论文作者专项资金资助项月(199950)(H代:MYHCNMH(二献|3}合成随机引物作者简介:唐明娟(1972- ). 女，博七研究生联系作者:郫顺星E-nial:sxgao@hotmai.coDDI0 (CCCCCCGCCAAGC).DD20 (TGCCCAATTCTG192告rER NBorcHNoCTHNOLOGY Vol.14 No.3 May, 2003GICAT) .DD23(TGCCCCGCCCCATCC) .DD34(TCCGGA2结果ATTCTOGTGAC) .DD60(TCCCCATTCCGACTGT),1.3 cDVA第 一链的合成差异显示分别得到35个(PCR方法1)和52个用CTAB汰提取禍建金线莲RNAH.太除DNA的步骤参差示片段(PCR方法2):将这些片段再扩增后点膜.照Invingen公i试剂侖说明将进行取20μg总RNA样品，进行反向-Northerm,最后分别得到3个(编号为AlK~加入40 U HNasoOITW.I U DNuse1.20 mmol/1. Tris-HCl(pH8.4). 2 nnul/1, MgCl、50 mmol/1. KCI.室溢放置1532、AR-33、AR-35)和7个阳性片段(AR-DD17.min,加人1 μl EDTA(25 mmol/.)于 65C处理10 inin 以终AR -DD19 ,AR -DD20.AR -D1)23 .AR -DD37、AR -止反应。按照(DNA第一谜合成试剂盒说明(lvirogen)进行DD44、AR-DD47)。这10个片段测序后,发现方法1反转永、反现体系20 μul, 包括5 μl经DNasel处理过的总所得片段两端均为随机引物，此处只列出AR-3序RNA.0.5山10 mmol/I. dNTIP,2 μ H-TuMI (M 代表G、A、列。方法2所得7个片段5'端均为随机引物,3'为C;1 1ug/lul).5.5 μl DEPC处理的水。于650.反应5 min后立锚定引物.此处也只列一-个AR- DD20序列。具体序即冰浴，加入4 μl 5x第.链缓冲液,2 μl 0.1 uol/L. IYTT,列如下:1 μl RNuseOIT"， 42'C 2 min,加入1 μl Superseriptl 后.42C接着反应50 min.升温釗48C进行30 nin,70C终止反AlR-33:应I0 min.TGCCGGAATTCCGACTGTCCAGGCGTCGATTCGCECA1.4 PCR扩增TCCCCTATCGTTCCACCCI6CAGICCTGCGCCCGG以锚定引物I-Tm.M及随机引物(DD10.DI20.DD23.TCGGCTGCGCCGCGGAGCCGGAACACACACTCCTCDD34 .DD60)组成的I5组引物对逆转录产物进行PCR扩增.ATCAAACCCGCTGGACTAATCGCCCCCCACGTCCCCCTICTPCR反施所用锱定引|物与逆转录所用错定引物相同.依次加.TACCTCGGCCCCICCAACAACTTGCGGATGACAGAGGA人下列反应物:2 μl eDNA第-链反应物.2 μ锚定引物1I-CGCCTCACCCCACGCGCTCTTCCAGATACCCACGC0GGATM (20 ug/(u1).2 μ随机引物(20 ng/u1), 100 ummol/.GCCACCACAGGTTCCIGGATACTACACAGGACACIN;GCAATICTCCTTAATCCATTCATG0GCGTCACTAATTACATAACC;dN1TPC10 mmol/L).2 μl 10x PCR缓冲液.1.5 mmw/L MgCls .ACGCATTTCCCTACCTAACACAGICATACTTACTCCCCCC0.5"TauDNA聚合酶，补水至20μcPCR程序采用两种方TTACCCCCTTGCTTAATTCTTCACTTTC 1CATTCAGAG;法。万法I参照文献[3].具体为:94C 1 min ,409: 4 min.729:CACTCGGCACAAATCACATCCCTCAGCACCCCTGGGACC1 min,1 个循环:94C 45 s,60C 2 min.729. 1 nin,35 个循ATCGCAATCITTCTTTTAATAACAGTCGAATTCCGG环:720: I0 min.4t.方法2为优化方法:94C 5 min:94CCAATCACT30 s.40C 2 min,72C I min.25 个循环:949: 30 8.50T 1AR-DD20):min,72C 1 min,10 个循环;729C 10 min,4C。TGCCGAATTCTGGTCATTGACACTTTACTCCCTCTCG1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染ACATCTACATCCCGCAGAACAACATCACCCCAGGGAGGG按文献[S]配制8%变性聚丙烯酰胺凝胶.聚合1 h后60GACGTCICGCCTCAAGTTCCTCACCTTCCTTCTTCW恒功率电泳5h。银染参照文献[6]进行,GICTCTTCC0OCCCTCAC0GGTCCATCCCCGACTTATT1.6 差异条带的回收与再扩增CTCCACCTCAACTCCTACCACCCTCAGATCTACTTATTAAT用干净的刀片将日的条带放入0.2 ml EP管中，用吸头TICAAATATAAATATAATCCTTCTGCCACALCGCACCCAAG捣碎,加入20 μl尤菌蒸馏水，煮沸20 min.离心取4 μl进行TCCCCTGTAGCCCTCTATCGTCCTCCITTCCCTCCG ATTCATTGAGACTTATGGATAACACTATACTACCCAAAA40)山PCR反应。系统组成与上述DD-PCR相问。PCR 程序CCTT相应的采用两种、上述方法 1对应的再扩增程序为:94C 5min;949 45 s,60C 2 min,72C 1 min.40 个循环;729 103讨论min,49.. t述方法2对应的再扩增程序为:94C s min;94C30 s,50C 1 min.72C I min,30 个循环;72C 10 min,4C.mRNA卷异显示从1992年由梁鹏凹建立以来..7 反向-Northem鉴定.克隆、测序在硝酸纤维絮膜(N-Hybond,Pharmacia) 上点样10 μl .广泛应用于分离和克隆各种体外系统，寻找与细PCR产物。经化学变性后正反面紫外交联,窄温保存。探针的胞发育、营养调控、肿瘤的发生/转移/诊断.免疫反标记参照HRorhe公司的DIC Labeling Kit 进行,杂交.洗膜和应植物遗传、神经科学等有关的基因方面.是一种显色均按照Roche 公司的DIC Dxteetion Kit 进行。将杂交确分离术知基因的快速而有效的方法。它灵敏度高,可认为阳性的片段克隆到pGEM-T" FasyVetor(Promegu)。 碱裂以同时中国煤化工差异.也可同时解法"提取质粒。鉴定含目的片段的卤液送上海博亚公司测分离到. 但是,差异显示技术的YH. CNMHG1-直努力寻求解决的问题。经过多年的实践,研究人员不断优化此唐明娟等:muRNA 差外显示条件的优化193技术,包括引物的设计.PCR参数、鉴定假阳性、避免的。该方法是将获得的差异片段结合到尼龙膜上.分放射性污染等方面。我们经过实验证明,银染是代替别用对照和处理材料的RNA进行反转录标记,制备同位索显示差异条带的极好方法,它没有放射污染，成探针。这种方法与Northeni比较起来,只需制备两其灵敏度与同位索放射白显影方法相似，可以显示1个cDNA探针,大大减少了工作量.节省了经费和时Pg水平核酸的变化1810;而且方便、快速,整个银染只间:本工作在引物、PCR参数、差显条带的显示方法需要70 min便可知道差异结果，不需特殊设备,肉与假阳性的排除等方面均采用上述优化方法，获得限可直接看见空示DNA条带,可以很h便地从凝胶了较满意的结果。上:切下,这是同位素放射自显影法所无法比拟的。Kammer等人中改进了差异显示方法,将随机引参考文献物从最初的6至10个碱基增长到18个碱基,PCR采川一个低严渑的40C退火温度，后进行60C高严1郭顺星陈晓梅,于雪梅.金线莲菌根真菌的分离及其牛物話性研究[1]中国药学杂志，200.35(7):443谨的退火温度;回收差示片段再扩增时全采用高严[2] Liang P'eng, Zhu Weimin, Zhang Xiaoying. el a. Dffeentiall谨的退火温度。认为这样提高s可重复性,降低假阳display using one -hase anchored anligu- dT priners小Nueleie性,没有出现两端均为随机引物的情况,只有一个两Arids Researth, 1994, 22(25):5763|3] Von der Kanmer H, Albrecht C, Mayhaus M. et oal. ldentifiear端均为锚定引物的片段。然而木研究发现，按照此tion of genes repulated by musarinir acelylelulime reeplonsap-PCR条件，经杂交测序后得到的片段两端均为随机plication of an improved and stistically comprechensive mRNA引物。这是因为60C高退火温度下只有随机引物能ilerentia display teehnique[J]. Nuclcic Acids Research, 1999,27(10);2211结合上,锚定引物AT含量太高,熔解温度低,无法结[4] 唐明娟。郭顺星. 金线莲RNA提取方法的改进[I]. 中草约。合到模板上。为减少反向-Northern及克隆的工作2002. .33( 10):937量，防止单引物扩增，再扩增时我们采用单引物在[5|萨姆们鲁兑 J等.分子克隆实验指南[MI.北京:科学出版社，1992.1950C做PCR(只用.个随机引物或锚定引物做引[6]卢柽栋。 现代分f生物学实验技术[M].北京:科学出版杜.1991.318物),将单引物能扩出条带的除掉，剩余的用双引物[7| liang Peng, Pardee AB. Diferential display of rukaryotie me-才能扩出特异条带的片段才用于杂交。Genomyx 公senger RNA by means of polymeruse chain reaction[JI. Srience,1992,257:967司发明了-种HIEROCLYPHTN试剂盒叫,将荧光标[8] Basan BJ, Ciustavo Anles G. Gesho PM. Fiast and senstive记在锚定引物上,而且在3'端锚定引物及5'端随机silver staining of DNA in polyacrylamidr grls(J]. Anal Biochern.引物序列设计了特定的'T7启动子和M13序列,使1991,196:80引物序列上升至31和30碱基，进而i反转录的温度[9] Lohnann G, Schickle H. Bosch TCC. REN display.a rapid andefcient method for non -radiuctive diferential display and升到50C,PCR进行4个50C低温退火循环后其余mRNA isolation[J| Bio Tech, 1995,18:200全用60C退火。这样不仅大大提高了特异性,血且只[10] Simon HG, 0ppeneimer s. Advanced mRNA difrential display:isolation of a new diferenial regulated myosin heary chain- en-有结合了锚定引物的才能被扫描出现，防止r单引coding gene in amhibian limnb regeneration[I. Gene. 1996.172:175物扩增条带的切取。但是此方法要求昂贵的Geno-川Cenomyx Corpnration. Handbook for HIEIROCLYPHIN mRNAmyxSC扫描和Acquire SC program软件，限制了荧Profile Kit for Diferenial Display Analysis, for International Us光差显方法的进一步推广。[Z|. Coprigh,1997|121 Zhang H. Zhang R, Ling P. Diferentiall screning of grre e反向-Northem是Zhang|等人在1996 首次提出pression diference enriched by difterential diaplay U NucleicAcids Research, 1996, 24(12):2454中国煤化工MYHCNMHG