单一分布聚乙二醇的合成及其应用

第5期高分子通报55知识介绍单一分布聚乙二醇的合成及其应用冯柏成1,赵金铠2,管宪文3(1.青岛科技大学化工学院,青岛266042;2.青岛迪爱生精细化学有限公司,青岛266101;3.青岛润兴光电材料有限公司,青岛266024)摘要:聚乙二醇(PEG)经过对端基官能团化接枝到药物等生物活性分子上后,可提高药物等的水溶性、抗免疫原性、生物相容性和稳定性并降低毒性。工业级聚乙二醇由于杂质含量高尤其是其中二醇的含量过高、分子量分布过宽,不能直接用于药物等的改性。除利用聚合方法制备窄分布高纯度的聚乙二醇外,采用有机合成方法合成单一聚乙二醇链是有效的手段。对“单一链长( discrete length)”或者“单一分布( mono-disperse)”的聚乙二醇高分子聚合物的近年来主要合成方法的进展进行了综述并简介了其主要应用关键词:关键词:聚乙二醇;单一分布;官能团化引言聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG)价格低廉、用途广泛,属于一般的化学品,而官能团化的聚乙二醇如氨基聚乙二醇可以对生物活性分子改性,是实现药物传输及其控释等的重要中间体口-4。科学研究发现,聚乙二醇经过官能团化接枝到药物等生物活性分子上后,可提高药物等的水溶性、生物相容性和稳定性并降低毒性。由于聚乙二醇类化合物优异的生物相容性,已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于药物和食品等与人体有关的产品中。但是工业级聚乙二醇由于杂质含量高、分子量分布过宽,尤其是聚乙二醇单甲醚中的二醇含量过高,不能直接用于药物等的改性,因此合成单一分布聚乙二醇一直是该领域的研究热点。经过二十多年的努力,已有多家公司开发生产了药品级的窄分布聚乙二醇并对其进行了官能团化,如日本油脂化学、美国道化学公司等。目前,已有几支聚乙二醇化的药物上市,如第一代产品 Dagen°、 Oncaspar;第二代产品 PEG-Intron、 Pegvisomant、 Somavert·、 pegfilgrastim以及Neulasta·。在欧洲主要有罗氏公司的 Pegasys,即 peginterferon alfa-2a于2002年被FDA批准用于慢性C型肝炎的治疗。然而,尽管许多合成的聚乙二醇产品的分子量分布已经相当窄,最小已可以达到多分散系数(M/M)为1.05以下,但仍旧是不同分子量聚乙二醇的混合物,尤其是其中含有的杂质,往往导致对生物活性分子修饰过程的重复性难以保证。在药物等生物活性分子的研究应用中,避免引人混合物是普遍采用的策略高纯度是最终产物追求的主要目标之一,所以人们从很早就希望制备单一链长/分子量( discrete-length)的聚乙二醇或者单一分布( mono-disperse)的聚乙二醇纯化合物以应用于药物等领域。所谓单一分子量聚乙二醇理论上应为特定链长的纯化合物,最近常被特称为dPEG或者“准确PEG”( exact PEG)。1单一分布聚乙二醇的合成单一分布聚乙二醇可以经由多种化学方法合成,而其中效率最高的无疑还是采用聚合手段。当然,这种方法生成的产物必然是大分子混合物,只是产物的分yHs中国煤化工到非常窄的水作者简介:冯柏成,男,44岁,博士,副教授,任教于青岛科技大学,主要CNMH通讯联系人,E-mail:fbc515@163.com·56高分子通报2010年5月平。例如,以2-苄氧基乙醇为引发剂、氢化钾为碱,通过环氧乙烷阴离子聚合反应,制备了分子量为1000、2000和4500的大分子,产物的多分散指数(M/Mn)仅为1.04,即产物分布相当窄。但是,该方法的合成条件苛刻,对试剂和溶剂的纯度要求极高,大规模生产不易实现。尤其是,该方法不可能制备出单一分子量的聚乙二醇大分子,即我们通常要求的纯化合物。因此,采用有机合成手段制备大分子即化学接枝法制备单一分子量聚乙二醇成为常用的有效的手段。1.1早期工作在各种醚的合成方法中, Williamson醚合成法是最常用,最有效的方法,也是制备单一分子量的聚乙二醇的经典手段。但是许多早期的合成工作没有提供足够的产物的鉴定分析证据,推测得到的产物往往是低聚物或者杂质含量极高。例如,早在1939年,按照下述路线合成了聚合度n=6的聚乙二醇[6,72HOCH2CH2OH+2CICH2 CH2OCH2CH, CI CH3ONaH(OCH2 CH2)BOH(式1)>3d产物截取200℃/300pa馏分,可得较纯的六聚体,收率仅为45%。该法的主要副产物是单取代的聚乙二醇产物,也就是说,上述反应很难进行完全。H(OCH2 CH2)OH+ Cl(CH2CH2OCH2 CH2)Ch- H(OCH2 CH2)4Cl(式2)按照同样的方法,利用钾盐中间体H(OCH2CH2)OK合成了更高级的聚乙二醇包括H(OCH2CH2)18OH和H(OCH2CH2)42OH,但是为了得到纯净的产物必须进行复杂的后处理。诸如对粗产物进行数日的萃取后还要反复的重结晶。即使如此,所得的产物可能仍旧不纯。类似地,其他作者以低聚的二溴聚乙二醇(如Br(CH2CH2OCH2CH2)5Br)作为主要中间体,合成了所需的单一分布聚乙二醇如H(OCH2CH2)OH,H(OCH2CH2)OH0,1,H(OCH2CH2)15OH01。因此,这种方法的主要问题就是由于涉及的有关反应的选择性低,产物纯度往往不高。首先,从第一步的基于统计方法的路线里,两个双官能团化合物反应很难得到预期的聚乙二醇的纯单一钠盐与卤代中间体反应,生成的二钠盐参与反应会生成更多复杂的副产物;第二,生成的聚乙二醇的纯单一钠盐与二卤代化合物的反应难以完全反应,如报道的主要副产物是由于只有一个聚乙二醇的钠盐参与反应生成的含卤素的低聚物;第三,从文献中可以得出结论,醇钠(一ONa)中间体和卤素(-X)或对甲苯磺酰( tosyl即Ts),甲基磺酰( mesyl即Ms)等衍生物之间的区别不够大,所以,许多副反应存在于反应体系中导致副产物不时出现些近年来发表的文章仍旧把齐聚物称为单一分布聚乙二醇,例如聚合度为30或45的乙二醇齐聚物10)。通过 Ts-PEG-Ts和 PEG-Na反应制备了单一分布的聚合度为35的乙二醇齐聚物;由 Ts-PEGSTs和PEG5-Na反应得到了H(OCH2CH2),OH,其中x=10、15、20、25和35; Ts-PEG3-Ts和PEG3-Na反应得到30%的壬乙二醇和6%的戊乙二醇1等。严格的讲,这些早期的结果都没有生成单一分布的聚乙二醇化合物,仍旧是多种聚乙二醇分子的混合物,只有通过提纯才能得到较纯的产物1.2引入有羟基保护基团的聚乙二醇中间体合成单一分布聚乙二醇很显然,上述没有选择性的方法必然会生成大量的副产物。要得到有选择性的路线,就必须引入基团保护的中间体。如下所述,通过引入不同的羟基保护基团,得到了令人信服的结果1.21通过三苯甲基聚乙二醇〔 PEG-trityl和 PEG-Ts中间体合成单一分布聚乙二醇1该法起始的Ts(OCH2CH2)OTs和H(OCH2CH2)OTr要分别制备,所以整个路线较长。加上该过程涉及有可能导致聚乙二醇降解的不利的反应条件如高温等,该路线并不是很方便。而且,产品的提纯也不会很容易,由于原料及反应不完全产生的副产物性质相近,很难从产物里除去。Ts(OCH2CH2)OTS 2H(OCH2 CH2)OTr- Tr(OCH2 CH2)abOTressureH(OCH2CH2)a+OH中国煤化工(式3)1.2.2通过苄基聚乙二醇〔 PEG-Bn中间体合成单一分布CNMHG例如,苄基聚乙二醇与对甲苯磺酰衍生物在四氢呋喃中反应,制备了目标产物,收率为73%161第5期高分子通报572 Bn(OCH2CH2)3OH Ts(OCH2CH2)3OTs-Na, THF73%Bn(OCH2 CH2)gOB(式4)PEG-Bn与其卤代衍生物 Bn-PEG-CI也可制备目标产物[1,Na, THFBn(OCH2CH2)sOH Bn(OCH2CH2)4CI(式5)所引入的保护羟基的苄基基团可用加氢方法下脱去,在1.36MPa下加氢收率为88%16,在9.87MPa60℃下加氢1.5h,收率为96%1n。以 PEG-Bn和PEGM作为中间体制备了含有乙二醇片段的单一分布高分子混合物路线如下所示0)H(OCH2CH2)gOHH(OCH2CH2)nOHMsO(CH2)qCH2COOR,Bn(oCH2 CHa)no70%44%R,=Et, q=2Pd-cBn(OCH2CH2)nO(CH2)q COORCH3(oCH2CH2)moNaTEA. 83%m=2,57%NaoHNHS.EDCCHa(OCH2CH2)(m+n O(CH2CH2 COOR,4562%CHa(OCH2CH2)(m+n O(CH2)CH2 Co0(式7)Me-PEG-NHS式中NHS为N羟基琥珀酰胺(N- Hydroxysuccinimide)的缩写,EDC为1-乙基3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(1- Ethyl3-(3 dimethylaminopropyl)- carbodiimide)的缩写,是氨基酸合成中常用的缩合试剂。所合成的 Me-PEG-NHS是非常有用的对生物活性分子修饰的试剂。该方法涉及的反应温和许多,但仍需用到较为昂贵的PdC试剂,且所得产物仍不是纯品,只是基本单一分布的聚乙二醇混合物而已。13双官能团保护法由于单一基团保护存在的诸多缺点,人们还在不断寻求更有效的合成方法。迤今为止,最好的结果是 Loiseau、King和Hll等报道的双官能团保护法1,见式8。非对称化H(ocH2cH2)moH—-PG(ocH2cH2)m对甲基苯磺酸酯化H( OCH2CH2)nOHTsCL, Ag2O, KITS(OCH2CH2)nOH链增长Ts(OcH2 CH2)OPG2PG1(OCH2CH2)mnOPC2)pOPGPG,(OCH2CH2)m+nOHp=9,12longer PEG chains式8)长链的单一分布聚PEGn,即H(OCH2CH2)OH或者R(OCH2CH2)OH(其中n≥12,R为烷基或者芳环取代基)的合成还很少,该类物质的合成仍旧是合成领域很有挑战性的课题。在他们之前只有几个相对容易合成的对称PEGn,也就是H(OCH2CH2)OH中国煤化工为PEG被合成出来。这些产物的纯化过程很少被报道,产物的分析鉴定数合成X(OCH2CH2)nY类型非对称PEGn链的方法,其中XAYHCNMH干发了一个可以或者另一个保护基团,n为3,6,9,12,15,18和24。58高分子通报2010年5月尽管该策略解决了聚乙二醇合成化学里的许多问题,但是作者仅实现了数克级的反应,还无法利用该方法实现大量的制备。主要的原因是反应的步骤过长而且涉及的许多试剂如PdC、Ag2O等价格昂贵,使它很难应用到工业生产中。1.4综合法Davis, Crapps等通过多种方法结合来制备聚乙二醇衍生物,所以此处称作综合法。由于该类物质的巨大经济价值该方法已申请了国际专利20。他们采用的聚乙二醇的合成方法可以概括为以下三种:(1)收敛法R2-dPEGy-OR 2+2 R,-dPEGX-OHR1-dPEG 2+yO(式9)式中R1是羟基保护基团(PG)或者官能团(FG),R2是离去基团(LG),x或y=1-100该方法是利用单一保护的小分子聚乙二醇,与双官能团化的聚乙二醇反应来实现聚乙二醇链的增长。在催化剂的存在下,通过向反应混合物中加入离子化的试剂等方法制备单一分布的dPEG化合物该专利认为,2、4、6-三甲基苄(TMB)是最合适的羟基保护基团,对甲基苯磺酸酯(T)是最适宜的离去基团(2)逐步增长法R,-dPEGX-OH R3 dPEGy-OR2R1dPEGxy-OR3(式10)式中R3是保护基团或者官能团,R1和R2同上。这种方法是利用单一保护的小分子聚乙二醇,与双官能团化的聚乙二醇或者同时官能团化和单一基团保护的聚乙二醇中间体反应来实现聚乙二醇链的增长。反应产物可以是带两个同样保护基团的长链聚乙二醇,也可以是带两个不同保护基团的长链聚乙二醇,后者不仅可以继续进行链的增长,也用来合成更加复杂的聚乙二醇衍生物(3)分支法R3×1OHp+pR4 dPEGy-OR2→R3X4 o-dPEGyR)p或R3X识R少+PR4 dPEGy-OH→R3x40 dPEGyRa)p(式11)式中X是有机部分如带有一个或多个取代基的烷基,芳香或者芳烷基有可能包含羟基官能团。p从2到大约4,R4是不同于R3的保护基团或者官能团。很明显,分支法涵盖了前两个方法,具有更大的灵活性。这样一来,单一基团保护或者官能团化的聚乙二醇中间体,都可以与其它单或双官能团化的聚乙二醇反应实现链的增长,根据目标分子的结构常常可以设计出非常便捷的合成路线。总体上看,该专利的主要特点是强调了一个特殊保护基团2,4,6-三甲基苄(2,4,6trimethylbenzyl,TMB)的作用,并使用了多种碱性试剂,尤其是效果较好的叔丁基醇钾来促进醚合成过程。可惜的是,在实例部分该专利并没有给出有说服力的数据来印证他们的观点。此外,他们强调的利用相转移催化剂18冠6来和NaH一起促进醚合成等已有类似报道,如15冠-5和NaH早已被一起用来促进醚形成1,因此并不新颖。该法的主要缺点是,仍需利用昂贵的PdC来脱除保护基团,在某些情况下还要通过高压加氢来脱保护,条件相当苛刻。此外,使用一些特殊羟基保护基团必然会使成本增高。总之,从文献结果看, Loiseau等提出的双官能团保护法是目前为止最有效的合成单一聚乙二醇的方法。但是,在单一分布聚乙二醇的合成中,扩展的同系物链大多数通过商品化的短聚乙二醇链获得这些低分子量聚乙二醇化合物或者是单一保护/单一官能团化的,或者是已经双官能团化/双基团保护的聚乙二醇衍生物。显然,这种方法受原料来源的限制很大,尤其是为提高不对称聚乙二醇化合物的收率,单保护的聚乙二醇衍生物往往通过反应试剂大大过量的方法越一船徂鳳栅。许多合成方法都涉及到大量的提纯分离工作,制备大量的产物尤其是工业中国煤化工还需要寻求更好的制备方法来满足不断增长的需求。CNMHG第5期高分子通报2单一分布聚乙二醇的应用除了已知的聚乙二醇化合物的一般应用如作为药物辅料和纸张、橡胶等的添加剂外,聚乙二醇及其衍生物已被用来改善生物医用材料表面的血液相容性(2).此外,聚乙二醇衍生物的一个主要用途是对生物活性分子进行化学修饰即生物素化( biotinylation),姜忠义等2已经对其合成和应用等进行了综述,原则上文中所述的各种行生化方法基本上都适用于本文介绍的单一分布聚乙二醇,在前面的合成过程中也已经涉及到一些衍生化过程,本文就不再一一赘述。实际上单一分布聚乙二醇化合物可以看作是般聚乙二醇类高分子的部分升级换代产品,由于目前的合成技术有限以及对纯度和单一分布的高要求等导致的价格升高等因素,它的一个主要用途是经过官能团化后对生物活性分子进行生物素化,即通过官能团化使聚乙二醇与生物活性分子接合,如欧洲已经有利用该类物质与血色素结合制备血浆代用品的大项目2。采用聚乙二醇化( PEGylation)手段修饰生物分子制备代用血浆已发展成为一个重要的研究方向,其中美国的生物技术公司 Sangart开发的有特异氧气传输功能的产品已经完成了二期临床试验和三期临床注册。由于血浆的用量比普通药物大得多,同样含量的杂质会对人体产生更大的毒副作用,所以对用于接枝的聚乙二醇类分子的纯度要求的要更为严格,人们也更加期待着单一分布聚乙二醇衍生物尤其是高分子量的物质的出现实际上,用于生物分子化学修饰的分子量较小的单一分布聚乙二醇衍生物已有商品出售,如美国Quanta biodesign公司等出售如下面这些含有N羟基琥珀酰胺(NHS)片段的物质,价格大多非常昂贵:NHS-dPEGIz biotin:NHSSSdPEG biotin它们都可以与生物活性分子中的氨基反应,来提高分子的水溶性、非抗原性和非免疫性。如前面的专利所介绍的,其中NHS片段可以通过NHS试剂与 PEG-COOH反应制得。其中,长链的 NHS-dPEG12biotin(PEG12代表12个PEG重复单元)的制备必然涉及到聚乙二醇链的增长过程,所以其价格几乎是低分子量 NHS-dPEG4 biotin(4个PEG重复单元)的一倍。由于合成上的困难,人们期待已久的更长链的单一分布聚乙二醇衍生物尚未有商品出售。当然,用于生物分子修饰方面的聚乙烯醇化合物实例还很多。此外,许多其它单一或者双官能团化的聚乙二醇还可以作为化学修饰或者化学交联的试剂,如 PEG-NH2, PEG-COOH和 PEG-SH等都是有价值的中间体,其中以分子两端分别带不同官能团的聚乙二醇化合物在合成上利用价值更高,如NH2PEG-COOH等。但是这类物质的合成也相对复杂,价格更加昂贵。3前景展望受单一分布聚乙二醇合成手段的限制,目前的商品化的这类单一分布聚乙二醇化合物分子量都不高,包含12个以上重复单元的物质还很少见。所以,还需要中国煤化工成手段,开发出长链段、高分子量的纯聚乙二醇化合物并合成更为复杂的结为主的聚乙二醇高分子用于生物活性分子的改性,达到降低开发成本、减YHCNMH,訕着更多的性价比合理的真正单一分布聚乙二醇化合物的开发面市,它的广泛应用也将成为必然。高分子通报010年5月参考文献[1] Pasut G, Guiotto A and Veronese F M. 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Qingdao Running Photoelectric Material Co, Ltd, Qingdao 266024, China)Abstract: Polyethylene glycol PEG )can be conjugated to bioactive molecules afterbiocompatibility and stability, reduce the toxicity. However, industrial grade PEG can nor be usedfunctionalization of the end groups, and then improve their water solubility, anti-immunogenicityconjugation to medicines etc. due to high content of impurities, in particular high content of diol andwide polydispersity. Synthesis of single PEG chains was an effective approach to get suitable PEGmolecules for conjugation besides preparation of Peg polymers with narrow molecular weightdistribution via polymerization. The major methods for synthesis of discrete length or mono-dispersePEG polymers were reviewed and their application was briefly introduced.Key words, Polyethylene glycol; Mono-disperse; Functionalization中国煤化工CNMHG