聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的

西北植物学报2001,21(2):257261 Acta Bot. Boreal. -Occident. Sin.文章编号:1000-4025-(2001)02-0257-05聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产的影响陈正山,王勤(兰州大学生命科学学院生物化学和分子生物学系,兰州730000)摘要:在改良的B培养基中加入不同浓度的聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞进行摇瓶培养通过不同时期取样并测定细胞鲜、干重及用HPLC测定紫杉醇的含量。发现聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产均有明显的促进作用。聚乙二醇为10g/L时,对细胞生长最为有利,细胞培养16d就可达到最大生物量,其平均鲜重为28.73g/瓶,增重3.8倍,平均干重为2.14g/瓶,增重3.1倍。聚乙二醇为20g/L时,对紫杉醇的生产最有利,细胞培养25d时,培养基中紫杉醇的含量达到最高水平,其含量为2350μg/L,是不加聚乙二醇的11倍。关键词:东北红豆杉;紫杉醇;聚乙二醇;高压液相色谱仪中图分类号:Q946.8文献标识码:A Effects of polyethylene glycol on cell growth and taxol production in suspension cultures of Taxus cuspidata CHEN Zheng-shan, WANG Qin* (Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life Science, Lanzhou University Lanzhou 730000.China) Abstract: Cells of Taxus cuspidata were suspensively cultured in modified B, medium supplemented with different concentratioin PEG (Polyethylene glycol). Great effects of PEG on cell growth and taxol production were observed by determining fresh weight and dry weight of cells and taxol contents was determined with HPLC at different days of culture. 10 g/L PEG is the best concentration for cell growth. The highest biomass was achieved in 16 day's culture with 28. 73 g/flask of fresh weight and 2. 14 g/flask of dry weight, which increasing 3. 8 times and 3. 1 times respectively. 20 g/L PEG is good for258西北植物学报21卷 accumulation of taxol. Taxol concentration in medium amounted to the highest levels with 2 350 ug/L when the cells were cultured for 25 days, which is 11 times of that of PEG-free. Key words: Taxus cuspidata; taxol;e;l紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属(Taxus.)植物中分离得到的一种二萜烯类化合物12,它是一种新型、高效、广谱抗癌药物特别是对卵巢癌、乳腺癌、肺癌有较好的疗效5现在市场上供应的紫杉醇主要从红豆杉树皮中提取,但是树皮中的紫杉醇含量极低(0.01%)4,仅靠树皮来提供紫杉醇难于满足市场需要,而且长期砍伐红豆杉树又会导致资源枯竭,破坏生态平衡。因此,目前紫杉醇价格比较昂贵,一般患者难于支付。为满足社会对紫杉醇的需求,开辟新药源已成为国内外研究的热点,其中利用细胞工程法生产紫杉醇是一种行之有效的方法2,3自 Christen等1991年获得红豆杉细胞培养的第一个专利以来有关通过细胞培养法来生产紫杉醇的研究已取得巨大进展101,但如何降低成本、提高产量一直是人们讨论的热点。我们试图利用PEG大分子反渗透法诱导次生代谢产物向细胞外排放的原理,将PEG应用于东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞培养用以提高培养细胞的生物量和紫杉醇的化学量,而到目前为止,有关这方面的研究还未见过报道。本文初步研究PEG对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产的影响。1材料和方法1.1材料外植体取自本试验室栽培的东北红豆杉幼苗的幼嫩茎段,用改良的B培养基诱导成愈伤组织后继续传代培养。紫杉醇标准品, Sigma公司生产,纯度为97%;PEG为广东汕头化工厂生产的分析纯产品,分子量为6000;培养基为我们设计的改良B培养基,即B5基本培养基附加5mg/LNAA、3mg/L6-BA、2mg/L2,4-D、0.2mg/Lk、1g/L水酪蛋白解(Sigma)、1g/L甜菜碱(Sigma)、1g/Lpvp(Polyvinylpyrrolidone)和30g/L蔗糖,pH值5.8。1.2细胞培养及生长参数的测定1.2.1细胞培养用改良的B3培养基将传代培养24代的东北红豆杉茎愈伤组织配制成6g/100mL的细胞液,然后每250mL三角瓶中装100mL细胞液,即接种鲜重为6g/瓶(误差小于0.2g),接种干重为0.52g/瓶再分别加入5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L6个不同浓度的PEG,以不加PEG的细胞液为对照,于25C±1C下暗处摇瓶培养28d,转速为120r/min1.2.2细胞生长参数的测定培养第4天开始取样,以后每隔3d取样1次,每次每个梯度重复取样3次收集细胞,并称量鲜重,记录鲜重和平均鲜重,于恒温烘箱中40C烘2期陈正山等:聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产的影响2591.3紫杉醇的提取及HPLC测定1.3.1培养基中紫杉醇的提取量取50mL培养基,用CH2Cl2按1:1配比(培养基:CHCl2)萃取3次,合并CH2Cl2部分,减压旋转蒸发仪(上海生化仪器厂)在45C±10下浓缩至干。所得粗提取物用CH2O定溶至5mL,然后用HPLC测定紫杉醇含量1.3.2细胞中紫杉醇的提取干细胞经碾碎后用100m的滤网滤出细胞干粉,称取1g细胞干粉,用50mLCH2O浸泡3次,每次先用超声波振荡15min后继续浸泡过夜滤出CH2O部分,在80C1C下用减压旋转蒸发仪浓缩至干。所得粗提物先用50mL蒸馏水溶解,然后加入50mLCH2Cl2萃取3次,后面其它操作和提取培养基中紫杉醇的相同。1.3.3Hplc检测高压液相色谱仪: Waters510泵,991二极管矩阵检测器;柱长15cm,内径3.9mm;流动相:甲醇:CH3CN:水=29:27:44;固定相:4uC18;溶剂:甲醇;检测:Uv227nm;进样量:10L;流速:1.0mL/min;标准品:紫杉醇(Sigma)保留时间 11. 8 min.2实验结果2.1PEG浓度对东北红豆杉茎愈伤组织生长的影响经研究发现,PEG对东北红豆杉茎愈伤组织的生长具有明显的促进作用。鲜、干重差异均达到极显著水平(表1)PEG浓度为1g/L时,对愈伤组织的生长最有利,表现为细胞生长快速,褐化程度低,细胞呈微黄色,分散比较均匀,大多以单细胞或微小细胞团为主(显微镜观察)。细胞培养16d就可达到最大生物量,其平均鲜重为28.73g/瓶,增重3.8倍,平均干重为2.14g/瓶,增重3.1倍(表1)当PEG浓度小于或等于10g/L时,随PEG浓度的增加,细胞平均鲜、干重呈上升趋势,而PEG浓度大于10g/L时,情况刚好相反(图1)。表1PEG浓度对东北红豆杉茎愈伤组织生长的影响及差异显著性分析(培养16d) Table 1 Influence of PEG on cell growth and statistical analyses (cultured for 16 days)PEG浓度平均鲜重平均鲜重增长倍数平均干重平均干重增长倍数 PEG concentrations Mean FW Mean FW Mean Dw(g/L) (g/flask) (g/flask) Mean Dw0511.18±0.620.860.89±0.050.7114.63±1.061.441.18±0.081.251028.73±1.133.802.14±0.083.121524,88±1.293.152.03±0,092.902019.88±0.372.311.59±0.022.062515.26±0.591.541.14±0.031.193010.21±1.230.700.67±0.080.29鲜重方差分析千重方差分析 FW statistical analyses DW statistical analysesF值 Fvalue106.51101.80临界值 Critical valueF01=4.46F0.01=4.46显著性异极著极显著260西北植物学报21卷2500200032.51500210001.55000.500051015202530101316192225 PEG(/L) Days图1PEG浓度对东北红豆杉茎图2PEG为20g/L时培养基中愈伤组织最大生物量的影响紫杉醇的积累曲线 Fig. Influence of PEG on the Fig. 2 Accumulation curves of Taxol in highest biomass of callus medium supplemented with 20 g/L PEG2.2PEG对紫杉醇生产的影响PEG对紫杉醇的生产也有明显的影响。当浓度为20g/L时,对紫杉醇的生产最有利(表2)。培养10d时在培养基中开始检测到紫杉醇,其含量为43μg/L(图2),培养25d时培养基中紫杉醇积累达到最高峰,其含量为2350g/L(图2、图3)是对照组中紫杉醇含量的11倍PEG浓度小于或等于20g/L时,对细胞中紫杉醇含量无明显影响,但PEG浓度大于20g/L时,细胞和培养基中紫杉醇含量均呈下降趋势(表2)表2PEG浓度对紫杉醇生产的影响(培养25d) Table 2 Influence of PEG on Taxol production (cultured for 25 days)PEG浓度 PEG concentrations51015202530(g/L)胞外紫杉醇 Extracellular Taxol 2205506906402350160 (pg/L)胞内紫杉醇 Taxol in cells583853666380 (ug/g DW)3讨论PEG是一种高分子量有机化合物,植物细胞一般不能吸收如此大分子的物质。PEG的主要作用是改变细胞膜的微结构,从而改变细胞膜的通透性和作为高渗剂。因此,理论上讲,向东北红豆杉培养细胞中加入一定浓度的PEG可促进细胞间的相互作用,从而有利于细胞生长,PEG改变细胞膜的微结构则有利于紫杉醇的释放,较高浓度的PEG提高2期陈正山等:聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产的影响261 mV1290.7853.8416.90.01.53.04.56.07.9.010.512.013.515.0 (Minute)图3HPLC图谱PEG为20g/L时细胞培养25d紫杉醇的积累达到最高水平,其含量为2350g/L Fig. 3 HPLC determination The highest amount of Taxol was 2350 pg/. when cells were cultured in medium supplemented with 20 g/. PEG for 25 days本研究发现,不同浓度的PEG对东北红豆杉茎愈伤组织的生长及紫杉醇的生产具有不同的影响。其中10g/LPEG为细胞生长最适浓度,细胞培养16d就可达到最大生物量,其平均鲜重增加了3.8倍,平均干重增加了3.1倍。PEG为20g/L则有利于培养基中紫杉醇的积累,培养25d时培养基中紫杉醇的积累达到最高水平(和 Penstechanker等报道的24d达到最高峰基本一致),其含量为2350g/L本研究还发现,当PEG浓度为20g/L时,96%的紫杉醇都积累在培养基中,这给紫杉醇的分离提纯带来了方便。目前,虽然通过细胞培养法来生产紫杉醇的研究已取得巨大进展910,但离商业化生产还有一段距离。其主要原因是目前培养细胞的生物量和紫杉醇的化学量还未达到商业化生产水平的要求因此本研究为今后有关提高培养细胞的生物量和紫杉醇的化学量方面的研究及紫杉醇的商业化生产提供了有益的参考。参考文献: [] ELLIS D D,ZELDIN E L, BRODHAGEN M, et al. Taxol production in Nodule cultures of Taxus]. Journal of Natural Products, 1996,59(3): 226-250.2]李家儒,曹孟德,刘曼西,等前体物对红豆杉培养细胞中紫杉醇生物合成的影响[J]植物学研究,199919(3):356-360. [3] THOMAS J H, LUIS P. VENKATEST S,et al. Taxol production in suspension cultures of Taxus baccata[]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1996,44: 99-102.4孙彬贤章国瑛刘涤等红豆杉细胞培养与紫杉醇生产[J]植物生理学通讯1999.35(2):135-140. [5] COLLINS-PAVAO M. CHIN C K. PEDERSEN H. Taxol portitioning in two-phase plant cell cultures of Tazus brevifolia[)]. 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