乙醇预处理麦秆的酶解性能研究

第12卷第1期生物加工过程Ⅴol.12No.12014年1月hinese Journal of Bioprocess EngineeringJan.2014doi:10.3969/i.isn.1672-3678.2014.01.001乙醇预处理麦秆的酶解性能研究陈红梅,赵雪冰,刘德华(清华大学化工系应用化学研究所,北京100084)摘要:釆用H2SO催化和自催化乙醇法对麦秆进行预处理,比较预处理后麦秆的主要化学组成、纤维素酶解性能和半同步糖化发酵生产乙醇特性,并进行物料衡算。结果表明:H2SO催化和自催化乙醇预处理过程中纤维素固体收率大于90%。添加非离子表面活性剂吐温0和吐温80没有显著提高H2SO催化乙醇预处理后纤维素的酶解笥糖得率及半冋步糖化发酵过程中乙醇的产量,而对自催化乙醇处理后麦秆的酶解和半冋步糖化发酵过程有·定程度的促进作用,相应的酶解葡聚糖转化率由η2.7%提髙到δ5.0%,而半冋步糖仳发酵过程中乙醇质量浓度提高了11.4%。物料衡算结果表明:酸催化和自催化乙醇预处理后葡聚糖回收率分别为91.0%和95.4%;半同步糖化发酵生产乙醇的得率分别为10.4和11.6g(按100g原料计)关键词:有机溶剂预处理;麦秆;酶解;半同步糖化发酵中图分类号:TQ353文献标志码:A文章编号:1672-3678(2014)01-0001-07Enzymatic digestibility of ethanol pretreated wheat strawCHeN Hongmei. ZHAO Xuebing. LIU DehuaInstitute of Applied Chemistry, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China)Abstract: Wheat straw was pretreated by sulfuric acid-catalyzed ( SAC)and auto-catalyzed(AC)ethaneellulose digestibility and ethanol production byhemi-simultaneous saccharification and fermentation ( hSSF )of pretreated solids were compared. Theresults showed that SAC and AC pretreatments recovered more than 90% of cellulose as solidphase. Addition of non-ionic surfactants Tween 20 and Tween 80 did not significantly improve thenzymatie digestibility and ethanol production of SAC-pretreated wheat straw. However, they showed somepositive effects on AC-pretreated wheat straw, with the corresponding enzymatic glucan conversionincreased from 72. 7 to 85. 0%0 and ethanol concentration increased by 11. 4%. Material balanceanalysis showed that glucan recoveries, as a solid phase, were 91.0% and 95. 4% for SAC and ACpretreatments, respectively. Corresponding ethanol yields were 10. 4 and 11.6 g per 100 g raw materialduring SSF process, respectivelyKey words: organosolv pretreatment; wheat straw; enzymatic hydrolysis; hemi-simultanesaccharification and fermentation木质纤维素是一种产量丰富、来源广泛、廉价的可再生资源。近些年来,由于化石资源短缺和温枚稿日期:2013-11-22基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(2011CB707406)H中国煤化工作者简介:陈红梅(1988—),女,江西赣州人,博士研究生,研究方向:木质纤维素生物炼制CNMHG-mail; zhaoxb@mail. tsinghua. edu. cl生物加工过程第12卷室气体排放量大幅增加,木质纤维素转化生产燃料等试剂均为市售分析纯。高效液相色谱(HPLC)用和化学品受到世界各国的广泛关注。但由于木标准品,包括葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖、糠质纤维素本身结构复杂,特别是半纤维素和木质素醛、甲酸、乙酸、乙醇等购自 Sigma- Aldrich上海分公限制了纤维素的酶催化水解性能。因此,木质纤维司。纤维素酶为诺维信公司生产的 Celli@ CTec2。素原料往往需要经过预处理以破坏其抗生物降解1.2主要仪器和设备屏障从而提高纤维素酶对纤维素的可及性2。木预处理反应器为天舟海泰(北京)科技有限公质纤维素生物转化的预处理方法有多种,常用的包司的TFCF5-5型5L不锈钢高压反应釜。液相色括稀酸预处理、蒸汽爆破(或超临界CO爆破)、热谱仪为日本岛津公司的HPLC系统,色谱柱为Bio-水预处理、氨纤维素爆破、氨水循环渗透和石灰预Rad公司的 Aminex hpx-87H(300mm×7.8mm)处理等34。有机溶剂预处理是采用有机溶剂或其填充柱,检测器为岛津公司RD-10A差示折光检水溶液在添加或不添加催化剂的条件下对木质纤测器。流动相为5mmol/L稀H2SO4,流速为0.8维素原料进行预处理的方法。在有机溶剂预处理mL/min,柱温为65℃。紫外分光光度计为上海天过程中,由于木质素和半纤维素的脱除,原料孔隙美科学仪器有限公司的UI-ⅥS85系列紫外/可见率增加,从而提高了纤维素与纤维素酶的可接触面分光光度计积。有机溶剂预处理一方面可以有效提高纤维1.3实验方法素的酶解性能,另一方面在预处理过程中可水解半1.3.1自催化乙醇处理纤维素、溶解木质素,因而是一种分级预处理,有利自催化乙醇是在笔者所在实验室之前优化后于实现原料的分级加工利用。的条件下进行的。150g麦秆置于高压反应釜中,加乙醇预处理是目前研究较多的有机溶剂预处人1500mL体积分数65%的乙醇水溶液,在300理方法6。乙醇具有低毒、挥发性大、易回收利用r/min下进行预处理。预处理温度为220℃,保湿20的特点。目前,将乙醇作为溶剂处理木质纤维素原min。反应结束后冷却到40℃以下,离心,收集液料研究较多的是自催化乙醇处理法和酸催化乙醇体,固体用相同浓度的乙醇溶液以10:1(mL/g)液处理法ν妇。自催化乙醇处理法通常是指除乙醇固比洗涤,再离心,收集液体,将固体进行减压蒸外,不添加任何化学药品作催化剂,而依赖于预处发,回收乙醇。所得固体保存在自封袋中,放入4℃理过程中释放的有机酸(主要是乙酸)来提供所需冰箱保存待用。酸度的乙醇处理法,反应温度通常为180~210℃。1.3.2酸催化乙醇处理酸催化乙醇处理法是向体系中添加外源有机酸或H2SO催化的乙醇预处理过程与自催化过程类无机酸作为催化剂,从而促进脱木素作用和半纤维似,不同的是乙醇质量分数60%,且在预处理过程中素水解,加入酸性催化剂可降低反应温度和添加30mm/LH2SO作为催化剂,并在190℃下保压力温1h。其他过程与自催化乙醇预处理相同。为分析和比较乙醇预处理后麦秆的纤维素酶1.3.3酶解实验解特性,笔者分别在最优条件下对麦秆进行H2SO预处理后固体的酶解在50mL三角瓶、pH4.8催化和自催化乙醇处理,比较这2种乙醇法处理后的醋酸缓冲溶液、50℃和150r/min条件下进行。麦秆的主要化学组成、纤维素酶解性能和半同步糖体含量为10%或15%(10%和15%分别指100化发酵生产乙醇特性,并进一步获得物料衡算数据。mL液体中所含绝干固体质量为10g和15g)。纤维素酶用量为20FPU(按1g固体计)。间歇取样材料与方法测定液相中纤维二糖、葡萄糖和木糖的浓度。预处1.1主要原料和试剂理后的纤维素酶解性能以液相中单糖浓度以及酶实验所用的小麦秸秆产自山东省,风干后待解聚糖转化率来描述用。将其破碎成<2cm的片段。采用美国国家可酶解葡聚糖转化率的定义为酶解过程中转化再生能源实验室的方法测定3其主要化学组成:葡为葡萄糖和纤聚糖33.1%,木聚糖22.8%,酸溶木素2.21%,酸不葡聚糖H中国煤化工CNMHG溶木素22.1%。乙醇、H2SO4、CaCO3、醋酸钠、吐温100%(1)P第1期陈红梅等:乙醇预处理麦秆的酶解性能研究式中:p、P。分别为葡萄糖、纤维二糖质量浓度,酶用量为20FPU),进行预水解24h(水解条件为g/L;x表示预处理后试样中葡聚糖含量;1.1是葡50℃、130r/min),随后按10%的接种量接入酿酒聚糖转化为葡萄糖的转化系数;为初始固体质量酵母( Saccharomices cerevisiae cicc31014)种子液浓度,g/L进行乙醇发酵。发酵温度为37℃,摇床转速为1501.3.4半同步糖化发酵实验min。预处理后固体的半同步糖化发酵(hSSF)在50m三角瓶中进行。将预处理后的纤维素固体(固2结果与讨论体含量为10%)置于发酵培养基中,121℃下灭菌2.1预处理后固体主要化学组成20min,再用浓度为1mol/L的NaOH溶液将液相H2SO催化和自催化乙醇处理后的麦秆的主要pH调至5.0~5.5,加入纤维素酶液(1g固体纤维素化学组成如表1所示。表1H2SO催化和自催化乙醇预处理固体主要化学组成比较Table 1 Main chemical compositions of wheat straw pretreated by sulfuric acid-catalyzed(SAC) andauto-catalyzed(AC)ethanol organosolv processes处理方式固体回收率v(葡聚糖)w(木聚糖)v(酸溶木素)(酸不溶木素)v(总木素不经处理的原料22.824.3SO4催化乙醇预处理自催化乙醇预处理50.562.617.30.73由表1可知:自催化乙醇处理的固体回收率为50.5%,而酸催化乙醇法处理的固体回收率相对较低,为42.1%。与自催化乙醇处理相比,酸催化处000000理的试样葡聚糖含量更高,而木聚糖和木素含量都更低,特别是木聚糖含量显著减少,木聚糖水解率20超过90%。自催化乙醇预处理过程中木聚糖水解率仅为61.2%。这是因为H2SO4催化乙醇预处理过z0.5g/吐温80程中,添加外源无机酸促进了半纤维素水解。从木素含量来看,H2SO催化的乙醇预处理后,总木素含量下降至10.5%,相应的木素脱除率为81.8%;自催化乙醇预处理后总木素含量为13.5%,相应的木素脱除率为71.9%。添加无机酸有利于木素的脱小卧除,这是由于酸浓度较高的情况下更容易使半纤维素和木素之间以及木素分子内的连接键断裂,形成更多的木素碎片01,1+151H2SO4催化乙醇预处理麦秆的酶解2.2纤维素的酶解性能Fig. 1 Enzymatic hydrolysis of wheat strawH2SO4催化和自催化乙醇预处理麦秆在10%和15%固体含量及添加不同浓度表面活性剂条件下的SAC) ethanol organosolv process酶解时间曲线如图1和图2所示。由图1和图2可以看岀,24h之后葡聚糖酶解转化率无明显增加。聚糖转化率最高可达80%,相应葡萄糖质量浓度分H2SO4催化乙醇处理麦秆在2种固体含量下葡聚糖别为50.2和中国煤化工的最终转化率均为70%左右,而葡萄糖质量浓度分添加表面CNMHG对于2种预别为55和78g/L。对自催化乙醇预处理的麦秆葡处理后固体的酶解性能具有不同的影响。对于生物加工过程第12卷别是,当固体含量较低时,未与木素结合的表面活性剂更多,对酶活的抑制作用更强烈,导致葡聚糖如转化率明显降低。同种表面活性剂中,高浓度的表盖盖40面活性剂比低浓度条件下的葡聚糖转化率稍低也量20验证了这一点。而自催化预处理后固体的木素含10量较高,因此,表面活性剂对酶解表现为促进作用此外,表面活性剂的作用还可能与木素结构有关四50g/吐H2SO催化预处理过程中由于酸浓度较高,更容易发生木素的缩聚反应,因而会降低木素分子中酚羟基的含量。而文献报道,酚羟基是木素无效吸附纤维素酶的一个主要官能团51。因此,木素官能团结构的变化可能是表面活性剂对H2SO4催化和自催2化预处理后固体具有不同影响的主要原因之一。具体的机制还需进一步研究。图2自催化乙醇处理麦秆的酶解H2SO4催化和自催化乙醇预处理麦秆亦有文献Fig 2 Enzymatic hydrolysis of wheat straw报道。 Wildschut等在相同条件下对麦秆进行pretreated by auto-catalyzed (ACH2SO4催化乙醇预处理,酶解聚糖转化率可达ethanol organosolv process89.4%,但其酶解实验的固体含量为3%,最终葡萄糖与纤维二糖总质量浓度为2.1g/L。而本文中,H15SO催化乙醇预处理的固体,添加表面活性剂不预处理后酶解葡萄糖最高质量浓度可达80.3g/L但未能促进纤维素的酶解,反而一定程度上抑制了(15%固体含量,未添加表面活性剂)。对于自催化酶解过程。特别是在10%固体含量的条件下,这种乙醇预处理, Huijgen等在60%乙醇、200℃、保抑制作用更为明显。而对于自催化乙醇预处理,吐温60min、固液比1:10(g/mL)的条件下对麦秆进温20和吐温80对于纤维素的酶解具有明显的促进行预处理,所得纤维素固体的酶解葡聚糖(酶解固作用。例如,当添加0.5g/L吐温20时,在10%和体含量为3%,其余条件和本文的相同)转化率仅为15%固体含量下,酶解24h时,葡聚糖转化率可分52%左右。而本文中,麦秆通过自催化乙醇预处理别由未添加时的74.3%提高至81.0%及62.2%提后,最高葡聚糖转化率高于80%(10%、15%固体含高至75.0%。表面活性剂对于H2SO4催化和自催化量)。可见,笔者所采用的自催化乙醇预处理可以乙醇预处理后的固体酶解性能具有不同影响作用有效提高麦秆纤维素的酶解性能。的现象可能与H2SO4催化和自催化预处理后固体的2.3半同步糖化发酵生产乙醇木素含量及结构有关。已有的研究表明,表面活性H2SO催化乙醇处理麦秆半同步糖化发酵剂提高预处理后纤维素酶解性能主要是通过降低(hSSF)过程中乙醇浓度和葡萄糖浓度的变化如图3木素对纤维素酶的无效吸附来实现的2-13,1所示。从图3中可以看出,表面活性剂的添加对最底物中木素表面有一定数量的位点,既可与表面活终乙醇浓度并无显著影响。在预水解过程中(前24性剂结合,又可与纤维素酶结合。当表面活性剂用h),葡萄糖浓度迅速增加,接种培养8h后葡萄糖很量达到一定程度时,这些位点全部吸附表面活性快被消耗,相应的乙醇浓度迅速增加。接种培养12剂,从而阻止木素对纤维素酶的无效吸附,使纤维h后乙醇浓度达到最大,此后乙醇浓度开始下降。素酶水解速度和得率提高。进一步提高表面活性这种现象可能是因为葡萄糖的产生速率不及其消剂用量反而抑制酶活,降低酶解性能M。H2SO4耗速率,酵母菌在饥饿状态下开始反耗产生的乙催化乙醇处理过后的固体中木素含量较低,能与表醇,也可能是由于随着发酵过程进行,乙醇逐步挥面活性剂结合的位点数量有限,因此即使添加少量发造成的。从中国煤化工乙醇质量浓的表面活性剂(例如0.5g/L),亦能使木素的结合度最高达到CNMHG2%的理论位点饱和,且表现出对酶催化过程的抑制作用。特得率第1期陈红梅等:乙醇预处理麦秆的酶解性能研究10对照●0.5g/吐温200.5g/吐温2050g/吐温204050g叶温8080t/h图3H2SO催化乙醇预处理麦秆半同步糖化发酵图4自催化乙醇预处理麦秆半同步糖化发酵过程中过程中乙醇和葡萄糖质量浓度的变化乙醇和葡萄糖质量浓度的变化Fig 3 Ethanol and glucose concentration changes duringFig 4 Ethanol and glucose concentration changes duringhssF of wheat straw pretreated by sulfuric acidhssf of wheat straw pretreated by auto-catalyzed( SAC) ethanol organosolv processcatalyzed(AC)ethanol organosolv process自催化乙醇处理麦秆hSSF过程中乙醇浓度和木聚糖被水解,81.8%的木素被脱除;而自催化预处葡萄糖浓度的变化如图4所示。从图4中可以看理过程中,木聚糖水解率为61.2%,木素脱除率为出,表面活性剂的添加对乙醇的产生有较好的促进71.9%。从液相中的糖浓度来看,2种预处理过程作用,不仅提高了最终乙醇浓度,而且减小了酵母中木糖浓度均很低,这可能是由于预处理在较为剧菌对乙醇的反耗。在接种培养8h之内,表面活性烈的条件下进行,木糖发生了显著降解。从图5和剂对乙醇产生的作用不明显,因为预水解过程产生图6还可知:100g麦杆原料通过酸催化乙醇预处了大量葡萄糖,使得该时间段内葡萄糖浓度较高,理,最终能得到10.4g乙醇,乙醇得率为理论得率足够供酵母消耗产生乙醇。接种培养8h后,乙醇的56%;而通过自催化乙醇预处理,最终能得到浓度增长速度缓慢,接种培养24h后乙醇浓度达到1.6g乙醇,乙醇得率为理论得率的62.5%。由此最大。未添加表面活性剂的对照组乙醇质量浓度可见,二者具有类似的乙醇得率。但H2SO4催化过最高为20.1g/L(接种培养24h后),相当于57.2%程添加了外源无机酸,会一定程度上增加设备腐蚀的理论得率;而添加表面活性剂的实验组乙醇质量性,且H2SO需要中和处理。而自催化预处理需要浓度最高可达224g/L(添加5g1吐温80,培养更高的温度,因而要求设备具有更高的耐压性。因24h),相当于65.4%的理论得率,比对照组提高了此需要进一步结合后续产品分离以及设备投资等114%。与H2SO催化的预处理相比,自催化预处分析,来比较二者的经济性。理可获得类似的乙醇浓度和得率。3结论2.4物料衡算进一步分析H2SO4催化和自催化乙醇处理麦秆通过比较H2SO4催化、自催化乙醇处理后麦秆的物料衡算,结果如图5、图6所示。从图5和图6固体的主要化学组成、酶解性能、半同步糖化发酵可知:大部分葡聚糖以固体形式回收,并在后续酶生产乙醇特性和物料衡算结果,可以得到以下结解过程中转化为葡萄糖。H2SO催化乙醇处理葡聚论:0乙醇预VT凵中国煤化工大部分葡聚糖回收率为91.0%,自催化乙醇处理葡聚糖回收率糖,HS0,催化CNMHG1.0%左右为954%。H5SO,催化的预处理过程中,90.3%的自催化乙醇处理的葡聚糖回收率为95.4%6生物加工过程第12卷00g麦秆原料33.1g葡聚糖22.80g木聚糖243g木素酸催化乙醇预处理(1L质量分数60%的乙醇溶液体1(539mL)0.09g葡萄糖固体1271g木糖0.71g阿拉伯糖同浓度乙醇溶液(0.5L洗涤,离心0.71g糠醛固体20g葡萄糖0.95g木糖0.27g阿拉伯糖回收乙醇42.13g绝干固体0.45g糠醛231m)30.1g葡聚糖443g木素半同步糖化发酵10.38g乙醇26g木糖图5H2SO4催化乙醇处理麦秆过程中的物料衡算Fig 5 Mass balance analysis of sulfuric acid-catalyzed( SAC) ethanol organosolv processe33.1g葡聚糖22.80g木聚糖自催化乙醇预处理(1L体积分数65%的乙醇溶液,离心液体1(520mL)0g葡萄糖固体10.13g木糖同浓度乙醇溶液05L洗涤,离心0g阿拉伯糖糠醛液体2(448m0g葡萄糖0g木糖0g阿拉伯糖50.47g绝干固体0g糠醛回收乙醇71mL)31.6g葡聚糖73g木聚糖木素半同步糖化发酵11:59g乙醇79g木糖图6自催化乙醇预处理处理麦秆过程中的物料衡算Fig 6 Mass balance analysis of auto- catalyzed(AC) ethanol organosolv processe②H2SO催化乙醇预处理可更多地水解半纤维素和同步糖化发酵阳泄用。而对于脱除木素。③添加非离子表面活性剂吐温20和吐自催化乙醇处中国煤化同步糖化发温80,对于H2SO4催化乙醇处理后麦秆的酶解和半酵具有显著的THE同m糖转化率可第1期陈红梅等:乙醇预处理麦秆的酶解性能研究从72.7%提高到85.0%;最高乙醇浓度比未添加表enzymatic cellulose hydrolysis[ J].J Chem Technol Biot, 2011, 86面活性剂时提高了11.4%。④物料衡算结果表明,11):1428-1438H2SO4催化的乙醇预处理和自催化乙醇预处理的麦[9] Xu F, Sun J X, Sun R, et al. Comparative study of organosolvlignins from wheat straw [ J. Ind Crops Prod, 2006, 23(2)秆半同步糖化发酵的乙醇得率分别为10.4和11.6180-193g(按100g原料计)。[10 Jimenez L, Perez J, Garca J C, et al. Influence of ethanol pulpingof wheat strawe resulting paper sheets [J].Process参考文献Biochem,2002.37(6):6656721] Zhao X, Cheng K,LiD. Organosolv pretreatment of[11张美云,蒲文娟,徐永健非木材纤维自催化乙醇制浆的研究1zymatic hydrolysis[ J]. Appl进展[J]中华纸业,2007,28(6):779Microbiol Biot, 2009, 82(5): 815-827[12]蒲文娟,张美云,徐永建,非木材纤维原料乙醇制浆的发展[2 Zhao X, Zhang L, Liu D Biomass recalcitrance: part I the前景与展望[J中国造纸,2007,26(8):52-56chemical compositions and physical structures affecting the [13 Sluiter A, Hames B, Ruiz R, et al. Determination of structuralenzymatic hydrolysis of lignocellulose[ J]. Biofuels Bioprodcarbohydrates and lignin in biomass[ EB/OL].[2013-10-281Biref,2012,6(4):465-482http://www.nrel.gow/docs/gen/fy13/426183] Wyman C E, Dale B E, Elander R T, et al. Coordinated 14] Huijgen W JJ, Smit A T, de Wild P J, et al. 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