RNA干扰技术的应用

综述·200年11月第45卷第20期RNA千扰技术的应用应彩云1钟鸣2(1南方医科大学第一临床医学院2004级医学影像学专业;2南方医科大学基础医学院2004级医学检验(医学实验技术)传专业广州520515)[摘要]RNA干扰是自然界生物中广泛存在的一种保守的自我保护现象。随着对RNAi发生机制的深入研究RNA正作为一种成熟的技术被研究工作者广泛应用于功能基因组的研究,如基因功能的检测、基因治疗肿瘤多药耐药研究、药物开发等。[关键词]RNA干扰;双链RNA;RNA降解;基因治疗;肿瘤多药耐药中图分类号R392-3[文献标识码]A[文章编号]1673-9701(2007)20-152-03RNA( RNA interference,NAi)干扰是指在生物体细胞内由种ATP结合蛋白(ATP- binding cassette,Bc)转运体有着密切于外源性或内源性双链RNA诱导体内产生序列特异的RNA关系。2006年, Parker等报道,RDE4是RNAi干扰产生过程降解的自然现象,是自然界生物中广泛存在的一种保守的自我中的另一个必需蛋白,RDE4D的二聚体对细胞内出现的内源保护现象。RNA干扰技术是近几年发展起来的一种基因研究工性或外源性长的dsNA具有高度的亲和力并可以优先结合到具,被广泛地用于功能基因组的研究,如基因功能的检测、基因 dsrNa上。利用特异的抗体将RDE4进行免疫沉淀,检查治疗肿瘤多药耐药研究和药物开发等。RNAi产生的主要原因RDE4的免疫沉淀复合物时发现,RDE4的免疫沉淀复合物是:在大多数的生物细胞内,由于外源性或内源性双链RNA中只有dRNA的存在,并没有检查出 siRNA的存在,因此,( Double stranded RNA, dsrna)的存在,在多种酶的作用下,RDE4在 siRNA介导的基因沉默的后续过程中并非必须产生与dRNA的序列相特异的mRNA分子降解使目的基因的的,可能只起到优先结合并传递 dsrNa给Dcer酶的作用,但表达量降低甚至消失,但并没有破坏或改变原来的目的基因,关于RDE4如何去辨别长的dRNA和iRNA的机制目前尚不即诱导产生转录后基因沉默( Posttranscriptional gene silencing,清楚。PTGS)。12RNA干扰诱导特异性基因沉默的特点作为一种新的功能基因研究工具,RNAi有着传统的基因研1RNA诱导特异性基因沉默的机制研究与特点究工具无法比拟的优点,传统上对一个基因的功能研究主要是1.1RNAi诱导特异性基因沉默的机制研究通过向细胞内引入需研究的靶基因的反义寡核苷酸,诱导靶基1998年,Fme等呵研究证明利用已知序列的 dsRNa能够特因的沉默,利用反义寡核背酸沉默目的基因不仅花费大操作复异性地阻断秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis elegans)体内的目的基杂而且周期长,不利于广泛地被利用。而利用RNAi降解mRNA因表达,RNAi开始广泛引起研究工作者的注意,并被用于多领使靶基因沉默,不仅花费少周期短操作简单同时具备其特有域的科学研究中但对于RNA的发生机制目前仍没有确切的报的优点。(1)高效性大量的研究发现,极少量的 dsrna进入细道普遍认为RNA现象的产生机制类似于细胞的“免疫应答”胞内就可引起细胞内靶序列的高度的表达沉默,通过对其深入机制四。 dsRNA进人细胞内被一种具有类似RNaeⅢ活性的核研究发现,细胞内存在着类似于“聚合酶链式反应”的机制。在细酸内切酶Dier结合,并被酶切成19~23nt的小干扰RNA胞内存在着一种可以在无需引物存在的情况下,直接以RNA为模( small interference RNA,iNA),在ATP的作用下,iRNA与由板指导RNA合成的RNA聚合酶( RNA-directed RNA polymerase,多种蛋白质结合形成且具有活性的RNA沉默复合物(RNA- - in- RdRP),当结合有 SiRNA反义链的RSC根据 Watdon-Crick的duced silencing complex,RIsC)结合,RC具有解螺旋酶的功基配对原则结合与反义链特异性互补的mNA后在降解能使与其结合的siNA双链解螺旋成单链释放正义链,保留NA的同时激活RdRP,激活的RdRP以RNA为模板合成新的反义链,随后识别并结合细胞内与其反义链相互补的 mrna dsrNa,新合成的 dsRNA再次被Dcer酶剪切成 siRNA, siRNA链。RSC将mRNA剪切成sRNA双链降解mRMA,使靶基因重复着上一过程,使sRNA的降解mRNA的效应起到放大的作表达沉默队。最近在秀丽隐杆线虫研究中发现RNA的发生与用大大增强了sRNA沉默目的基因的效率。(2)高特异性Brj Nurs,2005,14{4):205-210.中国煤化工阿宗土香老年患者失眠的护理措施及体会临床误诊误治,2000{8孙CNMHG失眠因素调查分析及护理19(5):84-85.对策生休健,以,3):38-59Birkholz G, Gibson JM, Clements PT. Dying patients' thoughts of ending(收稿日期:2007-09-30)lot study of rural New MexicoU]. J Psychosoc NursMent号獸生2007年11月第45卷第20期综述种 siRNA分子只对与其反义链特异性互补的mRNA起降解作后用Der或 RNaseⅢ体外消化长 dsRNA,得到各种不同的siR用如果去除 siRNA分子,基因沉默也随即消失。(3)可传递性NA片段混合物除掉未被消化的 dsRna后,混合物可以直接转RNA的效应可在生物体内不同的细胞之间传递甚至可随细胞染细胞。但利用Dier或RNaeⅢ消化体外转录形成的 siRNA转的分裂而传给子代细胞,使子代细胞同样具有对靶基因沉默的染细胞后较容易引起细胞内干扰素样反应,引发细胞内非特异的效能叫。基因沉默,导致细胞凋亡。(4)DNA载体体内制备 SiRNA目前,用于RNA干扰研究的质粒载体有很多种,但它们驱动2 siRNA的设计与产生方法shRNA表达所用的启动子大多相同,一般为 RNA polymeraseⅢ2.1 SiRNA的设的某些基因启动子如H和U6启动子,启动子的自身元素均位正确的设计和选择 siRNA靶序列可以有效地提高 siRNA沉于转录区的上游,且有明确转录的起始点、终止点,转录出的默目的基因的效能。目前sRNA靶序列设计主要是以Tuch的RNA无pyA尾,DNA载体可以带有cF、RF的报告基因,以siRNA用户指南以及 Ambion公司的 siRNA设计手册为指导的:监测转染效率同时可以带有表达抗生素的抗性基因,以筛选稳(1)在目的基因DNA中选择以AA(包括AA)起始的2nt序列,定转染细胞株DNA载体一次制备可多次使用,实验主要是在因为实验研究发现3'端带有UU的sRNA沉默目的基因的效率DNA水平上操作,对 RNase free的环境要求相对较宽但实验一更高而且可以更好地抵抗 RNase的降解;(2)避免选择起始密般需要较长的时间,且转染效率低。(5)慢病毒制备 siRNA码下游50-1004终止密码上游100以内的区域,避免选择( shrNA)a2目前主要是由 lentivirus介导的RNA干扰。5’或3非编码区域以及避免选择内含子区域;(3)避开4个或以 Lentivirus是一种逆转录病毒,可以整合入宿主细胞并长期表达,上的多囊A或多聚T的连续序列,以免转录过程的提前中断;但比一般的逆转录病毒拥有更高的滴度,不仅可以感染分裂期(4)针对目的基因选择2~4个的靶sRNA序列以便筛选能高细胞还能感染非分裂期细胞。利用 lentivirus构建的 shrNA表效沉默目的基因的sRNA序列,并尽量控制sRN序列中GC达载体,可以代替瞬时表达载体使用,而且 lentivins-shRNA载的含量在35%~55%;(5)选择合适的实验对照。最后,利用体经过包装系统包装成假病毒颗粒后,可以用于感染依靠传统BLAST对所选择的序列进行特异性分析围目前已经有许多转染试剂难于转染的细胞如原代细胞、悬浮细胞等,并且在感染网站可以提供 siRNA序列设计的免费在线服务如Ami公司的后可以整合到受感染细胞的基因组中进行长时间的稳定表达,在线分析软件。可以通过NCB网站查找感兴趣的目的基因的是目前制备稳定表达 shRNA细胞株和进行体内实验最为理想的mRNA序列登录 Ambion公司网站按照网站的指示操作,网手段站可设计出多个 BiRNA序列可供选择,最后可根据设计原则选择最合适序列3RNAi技术的应用与应用前景22sRNA的产生当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合研究发现, siRNA直接转染动物细胞后通常可以诱导细胞内到宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,宿主细胞内目的基因产生3~7d的高度的沉默,随后 siRNA随时间的延长常产生 dsrNa,随即引发RNA沉默现象。最初RNA沉默现象是逐渐地被降解靶基因的沉默现象逐渐得到恢复基因沉默的效从植物的转基因研究中发现的,被称为“共抑制(co- upper-率主要取决于细胞增殖速度和 SiRNA的效能叫。目前, siRNA主simn)”现象。后来研究发现“共抑制”现象主要发生在转录后的要是通过下面的五个途径来获得:(1)化学合成 SiRNA目前,RNA水平四。在研究粗糙红色链孢霉菌时也发现类似的现象,被以化学合成方法合成的 sirnA主要被用于体外培养细胞的短暂命名为阻抑作用( quelling)"。在研究线虫的特异性基因时发现实验。直接通过化学方法合成两条互补的21~23mRNA单链,突也具有同样的RNA沉默现象被命名为“RNA干扰”现象。随后出端为DNA碱基,增加了 siRNA对RNae降解的耐受性,两条RNA干扰倍受关注,广泛的被研究应用。在正常的生物体内互补单链经过退火形成双链 siRNA或发夹结构RNA,通过电转RNA干扰起到抗病毒、抑制基因过量表达的作用。目前,RNA导或质脂体的方法转染给细胞,拥有效率高和对细胞毒害作用干扰技术被广泛地用于功能基因的研究、肿瘤基因研究、药物小的优点转染率通常可以超过70%,且实验操作简洁,利用化筛选等领域。对一个感兴趣的基因的研究目前通常是通过两种学合成 siRNA对靶基因沉默的维持时间也较为短暂,一般72h途径:观察感兴趣基因的突变株的表型的变化或通过敲除或沉之内,但合成费用高,同时RNA较易被环境中的RNA酶所降默感兴趣的目的基因观察细胞表型的改变。在RNA被提出前,解所以对合成的条件和转染时的操作有严格的要求,目前主要对感兴趣的基因的沉默主要是通过反义技术来进行,但利用反用于已找到最有效的 siRNA情况下的实验研究。(2)体外转录合义技术对目的基因进行沉默,不仅操作复杂、特异性差效率成 siRNA在体外,利用RNA聚合酶的T3或T7启动子转录低。使用RNA技术沉默目的基因不仅操作较简单,且有特异性合成两条互补的21-23mRNA单链经过退火形成双链 siRNA,强效"发展,利用DNA载体和再转染给细胞,同样具有维持时间短暂的缺点,但较化学合成慢病中国煤化工建靶基因沉默稳定株方法的费用较低,目前主要被用于最有效的 SiRNA的筛选。成为CNMH数2在肿瘤的研究方(3)用Dcer或RNaⅢ消化体外转录形成的dRNA选择面RNA技术被广泛地用于新的肿瘤治疗靶基因的寻找新的200~1000mt的靶mRNA序列,体外转录制备长片段 dsrNa,然肿瘤药物的研发、新的肿瘤药物的作用靶点寻找和提高肿瘤细CHINA MODERN DOCTOR中国现代医生153综述·年11月第45卷第20期胞对抗肿瘤药敏感性研究等口测。RNAi在抗病毒的研究中也有short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells[JI Proc着重要的意义目前RNA技术已被广泛地应用于HⅣV研究和肝 Natl Acad Sci USA,20029996047-6052炎研究到。在药物筛选方面,RNA被用于寻找新的药物粑7 Yang D, Buchholz F, Huang Z et al. Short RNA duplexes produced by点和研发新的药物等。随着对RNAi的深入研究,RNAi的强hydrolysis with Escherichia coli RNase l mediate effective RNA inter-大的潜能正在被逐渐地发现和认识,尽管其目前仍存在较多ference in mammalian cells[]. Pmc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(15):的问题,如转染效率低、稳定性不高等,但随着对其研究的深人,RNA技术将必定成为人类战胜胂瘤、HV等疾病的强有18DhmE. Silver PA. Retrovinug-delivered siRNAJ)力的武器。2002,2(1:15.[19] Tiscomia G. Singer 0, Ikawa M, et al. A general method for gene参考文献interfering RNA[. Proe Natl Acad Sci USA, 2003, 100(4): 1844-1848,[I] Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interfer- [20]Li M, Rossi JJ. Lentiviral vector delivery of siRNA and shRNA encodingce by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[]. Nature, 1998.genes into cultured and primary hematopoietic cells[]. Methods Mol Bi-391(6669)806-81ld,2005,309(1)261-2722]Plasterk RH. RNA silencing: thestem/Jl Science, [21] Fish R, Kruithof EK. Short-term cytotoxic effects and long-term insta-20022965571)1263-1265bility of RNAi delivered using lentiviral vector[I. 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