菊芋生料联合生物加工发酵生产燃料乙醇

安徽农业科学, Joumal of Anhui Agri.Soi.2012,40(9):5438-5441實任编辑郑丹丹责任校对卢瑶菊芋生料联合生物加工发酵生产燃料乙醇杨梅,袁文杰2,凤丽华(1,吉林化工学院环境与生物工程学院,吉林吉林12大连厘理工大学生物科学与技术学院,江宁大连116023;:3.中国石油吉林石化公司炼油厂,吉林吉林132022)摘要[目的]在联合生物加工技术发酵菊芋生料生成乙醇工芑中,降低高浓度菊芋生料醪液的黏度,使菊芧发酵乙醇浓度达到或超过目前玉米乙醇的行业水平。[方法]利用马克斯克鲁维酵母( Kluyveromyces marxianus),通过添加辅助酶制剂、改变拌料水溫及优化补料方式等方法,降低发酵醪液黏度,提高菊竽生料的浓度,从而提高发酵终点的乙醇浓度并缩短发酵时间。[结果]最佳工艺条件为:45℃水拌料,pH5.0,添加0.10%酒精复合酶,发酵初始干粉浓度为λ40g/L,分别在发酵12和4h补料,菊芋干粉终浓度可达到300g/L,发酵时间48h,乙醇浓度达到9.6g/L,乙醇对糖的得率为0.464,为理论值的90.6%。[结论]此工艺为菊竽乙醉工业化的生产提供了有利条件。关键词菊芋;燃料乙醇;联合生物加工;马克斯克鲁維酵母;批式补料中图分类号S632.9文献标识码A文章编号0517-6611(2012)09-05438-04Production of Fuel Ethanol from Uncooked Helianthus tuberosus by Consolidated Bio-processing( CBP) FermentationYANG Mei et al College of Environmental Biological Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin, Jilin 132022)Abstract Objective] During the process of producing ethanol from uncooked Helianthus tuberosus by consolidated bio-processing( CBP)fermentation, the viscosity of high-concentration uncooked Helianthus tuberosus wort was decreased, which could reach or exceed the currentindustry level of corn ethanol. Method] By using Kluyveromyces marxianus, through adding assistant enzyme, changing water temperatureand optimizing fed-batch method, the wort viscosity was decreased and concentration of uncooked Helianthus tuberosus was improved, andthen, the final fermentation ethanol concentration was increased and fermentation time was reduced. Result] The optimum processing condtions were: temperature of water 45C, initial pH 5.0, adding 0. 10% alcohol compound enzymes, fed-batched at 12 h and 24 h, initial concentration of dry powder was 240 g/L, the final concentration reached 300 g/L, the final ethanol concentration was 91. 6 g/L and ethanol yieldwas obtained 0 464 for the theoretical value of 90. 6% at 48 h. Conclusion] The process will provide favorable conditions for industrializationproduction of Helianthus tuberosus ethanol.Key words Helianthus tuberosus; Fuel ethanol; Consolidated bio-processing: Kluyveromyces marxianus; Fed-batch菊芋(俗称洋姜、姜不辣)是一种非粮作物,与其他农作保持在较低的水平,防止糖积累而抑制菊粉酶分泌,避免底物相比有适应性强、耐贫瘠耐寒耐早种植简易、产量高等物抑制现象出现有利于维持较高的乙醇生产强度。但在菊优点。菊芋的块茎含糖量高,为其干重的60%~70%。菊芋芋发酵乙醇的过程中,由于菊芋干粉吸水溶胀,当底物浓度的主要成分菊粉是多聚果糖,可以通过酸解和酶解等途径加大以后料液黏度增大,流动混合困难影响传质传热,固转化为易于发酵的果糖。由于聚合度低,菊芋原料的水解比形物浓度成为发酵的限制因素。目前乙醇发酵菊芋干粉浓淀粉质原料还容易,不需要高温液化,直接菊粉酶水解以获度一般在200~250g1L6,当浓度大于250g/L,醪液黏度得可发酵性糖,工艺流程简单,能耗低。菊芋可以种植于滩显著增大,一般大于1.0×10°mPa·s,属于高黏度的非牛顿涂地、盐碱地或荒漠,不仅能为生物能源产品生产开辟新的流体,而一般淀粉质或糖基质的原料发酵液黏度小于100原料来源而且有助于保护脆弱的生态环境。在2007年国mPa·s。高黏度料液影响发酵过程中的传热与传质效果,发务院办公厅转发的国家发改委《生物产业发展“十一五”规酵过程产生的CO2也会因排出不畅而积累导致发酵速度减划》中明确提出“支持以甜高粱、木薯和菊芋等非粮原料生产缓,发酵时间长(60h以上),反应不完全,乙醇收率明显降燃料乙醇”,所以菊芓是一种具有发展前景的第二代生物乙低“”。若增加料水比,则产生降低终点乙醇浓度,增加精馏醇原料。能耗和废水处理成本等一系列问题。因此降低高浓度菊芋联合生物加工(CBP)技术首次提出是在纤维素乙醇生生料醪液的黏度,使菊芋发酵乙醇浓度达到或超过目前玉米产中23,指的是在发酵体系中利用同一种微生物把微生乙醇的行业水平,是菊芋原料乙醇发酵产业化过程中面临的物产酶过程和利用此酶水解和发酵过程组合,即产酶、水解、关键问题。为解决上述问题笔者使用具有分泌菊粉酶能力发酵3个环节耦合,具有底物和原料的消耗相对较低、一体乙醇发酵性能优良的马克斯克鲁维酵母( Kluyveromyces化程度较高的特点。菊芋生料发酵乙醇联合生物加工过程 marxianus),从添加辅助酶制剂、改变拌料水温和补料方式等是以菊芓为原料,菌体自产菊粉酶,菊粉水解和乙醇发酵由方面进行研究,以提高发酵液生料浓度降低黏度,缩短发酵同一种微生物完成;原料不需蒸煮和预先糖化,节省能源及时间,提高乙醇浓度和收率设备投资降低生产成本,同时还减少了因蒸煮而造成的可1材料与方法发酵性糖的损失;边产酶边糖化使发酵醪中单糖的含量始终11材料1.1.1菌种中国煤化工孝母,来源于大连理基金项目辽宁省基金项目(2008RC57)。工大学。作者简介杨梅(1972-),女,吉林吉林人,副教授,硕士,从事发酵工CNMHG程研究。1.1.2菊芋粉。子购目山东胶州灣(25%盐水灌溉)。鲜收稿日期201201-16菊芋块茎经洗净、切片、晾晒、烘干、粉碎过筛(相同的料水比40卷9期杨梅等菊竽生料联合生物加工发酵生产燃料乙醇5439下,干粉粒度越小,料液黏度越低,流动性越好但考虑到工比为1:3.6gg,测pH为50±0.1,发酵48h后检测乙醇还艺成本,采用60目为宜)得菊芋干粉。菊芋干粉总糖含量原糖和残总糖浓度。65%左右。表1拌料水温度对发酵的影响113辅助酶制剂。① )Accellerase Xy,木聚糖酶杰能科公水温黏度乙酶浓度乙醇收率残糖总糖乙醇理论司NBR),周20=30A,.45m当"收/厘151.54×10353.80.3435.5237.067.3科公司( GENENCOR),酶组分为纤维素酶(2200CMCU/g)和451.41×1059.70.3814.3528.274.7B-葡萄糖苷酶(525U/g),最佳pH为45~7.0温度为50~705137×10s9.90.3824.192.9749℃。③酒精复合酶,宁夏和氏璧生物技术有限公司酶活构成:β-葡聚糖酶≥136万U/m,纤维素酶≥1l万U/ml,半纤随拌料水温度的升高,料液溶解性加强(。试验采用一次性投料的方式进行发酵,菊芋干粉浓度比较高,因此在维素酶≥120万U/m,果胶酶≥0.3万Uml,蛋白酶≥1.5冷水拌料后黏度比较大。由表1可见,用pH0的4或55万U/ml。复合酶用量为原料干重的0.08%-0.10%。使用℃水拌料,搅拌10min,料液黏度明显降低,有利于发酵的进条件为pH4.0-5,5、温度25-56℃,最佳使用条件为pH行。但45和55℃乙醇终点浓度变化不大,为了降低能耗,4.8、温度50℃。同时考虑到发酵过程为了降低黏度加入的酶制剂的最适温12方法度在50℃左右,因此,选择拌料水的温度为45℃1.2.1种子液的培养。菌种分泌的菊粉酶是诱导酶因此22辅助酶制剂对发酵的影响前期研究发现,一次性投种子培养基添加菊粉。种子培养基配方为菊粉4%,蛋白胨料干粉浓度若大于240gL,料液黏稠,料液混合困难,影响2%,酵母粉1%,pH自然,30℃,接种后在30℃、转速150反应进行。发酵后期菊芋粉被充分酶解、利用后,料液黏度r/min条件下培养24h,其OD达到10左右,pH4.7~4.9。有所降低,但仍保持较高的黏度,说明料液中存在的多聚果L22乙醇发酵。称取60目过筛的菊芋干粉,用一定量的糖不是导致醪液高黏度的唯一原因料液中的其他成分如纤自来水拌料调pH接种10%种子液,达到一定的初始干粉维素、半纤维素果胶等成分的共同作用可能是造成高黏度浓度(包括种子液的体积),发酵在500ml三角瓶中进行,装的主要原因。因此在发酵拌料时分别加入 Accellerase液量为40%-45%,厌氧塞封口,放到30℃、150rmin摇床xY、 Accellerase100酒精复合酶等辅助酶制剂进行试验,考中培养。可以在发酵12或24h内补菊芋干粉,使其达到察不同酶制剂对生料黏度及发酵的影响。菊芋干粉初始浓定的菊芋干粉浓度。每12h取样分析测还原糖、总糖、乙醇度240g/L,加入一定量的酶制剂,用温度45℃pH40的自等参数。来水进行拌料调浆,搅拌10min,测定黏度,降温至30℃接1.2.3分析方法。种,此时料水比为1:3.6g/g,发酵12h补料,使菊芋干粉浓1.2.3.1总糖和还原糖含量。还原糖的检测采用3,5-二硝度达到270g/L。分别在发酵24、48h取样,通过测定发酵时基水杨酸(DNS)法,用果糖作标样绘制DNs显色的标准释放的CO2而造成发酵体系的减重估量乙醇的生成速度。曲线。总糖使用0.2mL硫酸水解1h,用DNS法测定。1.23.2乙醇浓度。由 Agilent6890气相色谱仪内标测不添加酶制剂一 Accellerase XY定:.Accellerase 1500Accellerase xy fo Accellerase 1500干粉浓度(g/L)=-酒精复合酶菊芋干粉量x100干粉量×0.55+拌料水体积+种子液体积(1)乙醇得率=乙醇生成量=乙醉摩生产量发酵液总糖量菊芋干粉量x65%乙醇转化率=乙醇生成量×109%其中,式(1)中的0.55为每克菊芋干粉溶于水所占的体积发酵时间‖h1.23.3酵母浓度。采用比浊法测定,种子液制得菌悬液图1酶制剂对发酵速度的影响后稀释10倍,用酶标仪在波长640mm下测光密度值。由图1、表2可知,添加酶制剂会对发酵有影响,能显著123.4黏度。醪液黏度由NDJ旋转式黏度计(上海精提高乙醇发酵终点浓度,降低残糖浓度。 Accellerase150科天平仪器厂)在30℃条件下进行测定(纤维素酶和β-葡萄糖苷酶)对发酵的影响明显高于 Accel-lease xy2结果与分析中国煤化利于CO2释放减少毒性,保持2.1拌料水温度对发酵的影响称取一定量的菊芋干粉,糖降低。同时添加分别用温度9154555℃,pH4.0的自来水进行拌料调浆,AccellerasecNMH单独添加效果更好。使干粉浓度达240g/L,搅拌10min后测浆液的黏度。料水发酵过程加入酶制剂对发酵速度影响比较大,发酵前24h5440安徽农业科学2012年表2酶制剂对发酵的影响加酶量黏度24h总糖,ma·乙醇浓度∥醇转化率∥%乙醇浓度∥g/L乙醇转化率∥%乙醇收率∥gg不添加1.34×10564.369.676.0.391Accellerase XY0.0179.10.41821.Accellerase 15008.47x1085.80.438Accellerase Xy和0.01和0.037.05x100.447Accellerase 1500酒精复合酸75.781.50.458注:*酒精复合酶是粉末加量为每100g菊芋干粉加01g内乙醇的发酵速度由不加酶时的2.68g(L·h)提高到3.00能改善。由图2可见,复合酶的加入使发酵速率提高,发酵g/(L·h)左右,其中加入酒精复合酶的发酵可达到3.15终点乙醇浓度相应增加。酒精复合酶添加量为0.15%时,乙g/(L·h)。加入酶制剂4h的乙醇收率由70%提高到80%醇浓度、发酵效率残糖、发酵强度等主要发酵指标与添加量左右,其中加入酒精复合酶后乙醇收率可达到83%,48h可为0.10%相比差别不大,考虑到发酵成本,最终确定酒精复达到90%左右。另外,12h镜检发现添加酒精复合酶发酵醪合酶的添加量为0.10%。中酵母外观形态好、数量增加、出芽率高。酒精复合酶中含表3酒精复合酶添加量对发酵的影响有β-葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和蛋白酶5种48h乙醇浓度48h残糖48h总糖加酶量∥%酶,其中纤维素酶是分解纤维素降低料液黏度的主要酶,半mPa·s05.纤维素酶和β-葡聚糖酶对纤维素酶水解具有明显的协同作9.42×103834.1521.用),破坏菊芋干粉结构,有利于释放菊粉,并增加可发酵0.107.02×10385.73.1019.1性糖快速降低醪液的黏度,提高乙醇收率。酒精复合酶中中056.47x10的蛋白酶和果胶酶可分解蛋白质、果胶降低醪液黏度,同时2.3投料方式对发酵的影响以上试验发现,当发酵菊芋为酵母提供更多营养,提高酵母生长优势,缩短发酵周期。初始浓度增加到270g/L时,发酵初期(前12h)由于菊芋干这5种酶共同作用分解菊芋块茎中的纤维素、半纤维素果粉浓度高发酵液中还原糖浓度可达到15g/L以上,发酵48胶等成分,明显降低料液的黏度,提高终点乙醇浓度和乙醇h后残还原糖浓度大约在20g/L。造成发酵终点残糖浓度高收率,因此确定酒精复合酶为最佳酶制剂的原因是在发酵初期还原糖浓度高,菌种的菊粉酶分泌受到由于酒精复合酶的添加能显著降低黏度,因此可以提高抑制,造成菊芋干粉糖化不彻底,残糖浓度偏高。为了降低初始菊芓粉浓度。为进一步提高终点乙醇浓度,将初始菊芋糖浓度改变菊芋干粉的投料方式,改变初始菊芋干粉浓度,粉浓度定为270g/L,考虑到发酵成本对酒精复合酶添加量通过不同时间补料,进行高浓度菊芋干粉发酵。进行了考察,加入量为0.05%~0.15%,加入复合酶后测定取不同菊芋干粉初始浓度,加入0.10%酒精复合酶,用发酵液黏度,发酵方法同前,发酵12h后补料,使菊芋粉浓度温度45℃pH4.0的自来水进行拌料调浆,搅拌10min,降达到300g/L。发酵过程总糖和乙醇浓度变化曲线见图2酒温至30℃接种,分别在不同时间(发酵12或24h)进行补精复合酶加入后测定的料液黏度及发酵48h酒精复合酶对料。补料为菊芋干粉,干粉最终浓度达到300g/L,具体的投发酵的影响见表3料方式见表4,发酵48h取样,考察投料方式对发酵结果的一不添加复合酶影响(表5,图3)。复合酶加量为0.05%复合酶加量为010%表4不同投料方式下的物料浓度B/L一复合酶加量为015%处理批式补料方式初始浓度12h浓度24h浓度分别在12和24h进行补240料,补充干粉量相同②分别在12和24h进行补料240③在12h补料1次300性投料表5投料方式对发酵的影响8h乙醇48h残糖48h总糖乙醇收率乙醇理详浓度∥g/Lg/L收率∥%发酵时间h0.46490.6图2酒精复合酶添加量对乙醇发酵的影响2)89.32.5010.10.45088.3③856020.00.43284.7在初始干粉浓度270g/L条件下,不添加酒精复合酶时,中国煤化工77.0料液黏稠,几乎处于静止状态,醪液内有气泡堆积,发酵产生一次性CNMHGL,料液黏度大,料的CO2不容易排出,随添加酶量增加到每100g原料0.15g,液混合不好,生LU2难排断,友醉液内有大量的气泡,影黏度从大于1.0×103mPa·s降至647×103mPa·s,混合性响发酵的进行转化率比较低。进行批式补料试验中,初始40卷9期杨梅等菊芋生料联合生物加工发酵生产燃料乙醇5441处理①处理②一●处理③处圈己发酵时间h发酵时间昌h图3补料方式对乙醇发酵的影响浓度为240g/L,在12和24h两次等量的菊芋干粉补料效果点,乙醇浓度达到91.6g/L,乙醇对糖的得率为0.464,为理最好,菊芋干粉终浓度达到300g/L发酵48h乙醇浓度为论值的906%,乙醇生产强度为191g/(L·h)。在此工艺91.6g/L,乙醇对糖的得率为0.464,为理论值的90.6%。通条件下进行菊芋乙醇发酵,具有工艺简单能耗低、发酵时间过批式补料可以降低初始发酵阶段的黏度,有利于料液的混短、乙醇收率高等优点,另外,可以在较高的菊芋干粉浓度下合,另外降低了发酵前24h初始阶段的还原糖减少底物抑发酵黏度小料液的输送性能好,有利于发酵醪液的精馏,制,有利于乙醇合成。为工业化的生产提供了有利条件。3结论与讨论参考文献菊芋生产乙醇在20世纪80年代相关研究报道最多的[1] 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Appl Environ Microbio, 1990, 56利用联合生物加工发酵乙醇将产酶、糖化、发酵3个环(11):329-36[7]袁文杰任剑刚,赵心清等.一步法发酵菊芋生产乙醇[J]生物工程节耦合,与使用商品菊粉酶或利用能够产生菊粉酶的菌株和学报,2008,24(11):1931-196具有发酵乙醇能力的菌株进行发酵乙醇相比,工艺简单,可8天轻工业学院大许船工业学院,无锡轻工业学院工业发酵分析发酵性糖被发酵为乙醇,在过程中不积累,可以有效防止杂[9] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Anal Chem, 1959, 31: 426-428菌污染,提高乙醇收率经济上更合理,受到国内外学者的广[10] XU TJ, ZHAO X Q, BAIF W. Continuous ethanol production using self泛关注。袁文杰等利用马克斯克鲁维酵母( Kluyveromycesflocculating yeast in a cascade of fermentor[J ] Enzyme Microbial Tech-marxianus)YXo以批式补料方式发酵在菊芋干粉浓度为[1]李杰辛本荣,隆小华等菊芋块茎的低温糊化及酸解条件的优化280gL时,发酵108h,乙醇浓度达到84.20g/L,乙醇对糖的[J]食品工业科技,2010(3):239-242得率为0405,为理论值的800%。俞静等利用鹰嘴豆孢[12] LI J J, TANG Y B, TANG X H, et al. composite application of enzyme inthe production of fuel alcohol fermentation of Jerusalem artichoke flour克鲁维酵母Y179同步糖化发酵菊芋生产乙醇,在菊芋干粉[J. Liquor-making Science&Technol[13] BERLIN A, GILKES N, KILBURN D, et al. 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