治疗性抗体的改造

学分子生物学杂志,2006,3(4):245249 J Med Mol Biol,2006,3(4):245-249院士述评治疗性抗体的改造沈倍奋军事医学科学院基础医学研究所北京市,100850沈倍奋,中国工程院院士,军事医学科学院基础医学研究所研究员,博士生导师。中国人民解放军分子免疫学重点实验室主任。现任中华医学会副会长,中国发明家学会副理事长。从事单克隆抗体和基因工程抗体的研究和应用多年,近年来与不同学科的专家合作致力于基于抗原一抗体相互作用的立体结构信息设计新功能分子的研究。在国内外学术期刊上发表论文200余篇,主编专著4部。【摘要】市场上已有18个被FDA批准的单克隆抗体,它们用于治疗如肿瘤、移植排斥、自身免疫病、病毒感染等人类疾病。治疗性抗体代表了生物制药业发展最快的领域之一。随着技术的发展,各种形式的工程抗体被构建来改善它们的特性和效能,包括:鼠抗体人源化,提高生物学活性,如亲和力成熟,改进效应功能,改善药代动力学。文章评述了这一领域的最新进展,同时也讨论了工程抗体的免疫原性和亲和力【关键词】单克隆抗体;治疗性抗体;基因工程抗体;抗体人源化【中图分类号】R392.116Improvement of Therapeutic AntibodiesInstitute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100850,ChinaAbstract] In the market, there are eighteen monoclonal antibodies approved by the FDA. Theyhave been used to treat human disease, such as cancer, transplant rejection, autoimmudisease..&tiviral prophylaxis and so on. The therapeutic antibodies represent one of the fastest growing areas ofthe biopharmaceutical industry. With the technology development, a diversity of engineered antibodyforms have been created to improve their characterization and efficacy, including humanization ofmurine antibodies, enhancing their biological activities such as affinity maturation, improvement ofeffector functions, and altering pharmacokinetics. This review summarized recent developments inthis field, also discussed the immunogenicity and affinity of engineered antibodiesKey words] monoclonal antibody; therapeutic antibody; engineered antibody; humanized anti-bod治疗性抗体是可以用来治疗疾病的抗体,因此中最重要的一大类,也是世界生物工程制药业的支也称它们为抗体药物。截至2005年5月,美国柱产品之一。FDA已经批准18个抗体药物,主要用于治疗肿抗体作为治疗性药物已有上百年的历史。当时瘤、自身免疫性疾病、病毒感染和器官移植时的排主要用抗血清进行治疗,由于其成分太复杂、多斥反应等。同时有100多种治疗性抗体正在进行变,而且是异源蛋白,在治疗时会出现严重副作临床试验,500多种抗体处于临床前研究。2003~用中国煤化工世,它是一种均一2004年抗体药物销售增长48.1%,突破100亿美性好CNMHG抗原决定簇的抗元。在以后几年里,抗体药物可能以更快的速度增体。1982年,Lewy制备了针对一个B淋巴瘤患者长,预计到2010年可达到300亿美元2。从抗体瘤细胞的抗独特型单克隆抗体,对该患者的治疗取药物的发展速度来看,目前它已成为生物技术药物得很好的疗效。这一结果引起了人们对单抗用于治沈倍奋.治疗性抗体的改造疗产生了极大热情和期望,单抗被称之为“魔维结构确定抗体高变区中与抗原结合的关键氨基弹”。但事实并非如此,以后试用的一些抗肿瘤单酸,然后将这些决定特异性的关键氨基酸移植到相抗并没有达到预期的效果。1986年,美国FDA批匹配的人抗体相应位置上。另一种常用的人源化方准抗CD3单抗OKT3用于抗移植排斥反应;1995法是表面重塑技术,即鼠抗体框架区表面氨基酸的年,欧洲上市17-1A鼠单抗治疗大肠癌。这些单抗“人源化”,通过鼠和人抗体可变区立体构象叠的临床应用显示出两个方面的主要问题:鼠抗体虽合比对,寻找合适的人抗体模板,将鼠Fv段表面然对靶抗原是非常特异的,但它不能激活相应的人暴露的框架区残基中与人Fv不同者改为人源的氨的效应系统,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用基酸,达到Fv的表面残基人源化,使免疫原性降(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)等;此低,由于不影响Fv的整体空间构象,所以仍保留外,鼠抗体作为外源蛋白进入人体,会使人体免疫与抗原的结合能力。系统产生应答,即产生人抗鼠抗体( human anti20世纪90年代,抗体库技术的出现为抗体人mouse antibody,HAMA),而且异源蛋白在人体内源化和人源抗体的制备开辟了新途径41。该技很快被清除,即半寿期很短4。因此,人们利用术将PCR扩增、抗体片段在大肠杆菌中功能性表重组DNA技术来解决上述问题561。达和噬菌体展示技术结合起来,在体外模拟体内的抗体生成过程。具体是利用PCR方法将B细胞中1抗体人源化改造所有抗体基因钓出来,克隆到载体上,使之表达于最早出现的人源化抗体是人-鼠嵌合抗体,将噬菌体表面,构建成噬菌体抗体库,然后用抗原筛鼠抗体可变区基因片段连接到人抗体恒定区基因选出表达相应抗体的噬菌体,经扩增、测序获得特上,由于IgG类型的抗体稳定性好,易纯化和保异性抗体基因。如果B细胞来源于人外周血,则存,因此嵌合抗体通常用凵gG型。人lgG有4个亚可得到人抗体。也可以通过合成抗体库获得人抗类,其中IgCI和lgC3亚类能结合补体,因此需要体。该技术基于对已有人抗体的序列信息进行聚类CDC效应来杀伤靶细胞的嵌合抗体采用IgCl型恒分析后,将可用的胚系基因及所有重排的序列进行定区。一般嵌合抗体的人源化程度可达70%。分组,所有序列中95%以上可归为14个亚组,其进一步人源化的方法很多,最早是CDR移植,将中7个VH亚组、4个V和3个V亚组,亚组的鼠抗体的互补决定区( complementarity determining每个成员之间都有高度同源性。因此,可以设计、region,CDR)移植到人抗体的相应部位,这样人合成14个亚组各自通用的基因,作为构建组合抗源化程度可达90%以上。但简单的CDR移植往往体库的主干基因,然后与上述方法相似,用抗明显降低抗原-抗体反应的亲和力,甚至丧失与抗原从合成抗体库中筛选出相应的抗体。原结合的能力。为了保留亲本鼠抗体的亲和力和特抗原表位定向选择( epitope guided selection异性,一些支持 CDR loop构型的鼠郾g框架区氨基的人源化方法就是利用抗体库技术进行鼠抗体人源酸也应该进行移植。随着计算机模建技术的发展,化的又一种方法。将鼠抗体的轻链或重链文库蛋白质晶体结构数据库中抗体和某些抗原晶体数据与人抗体的重链或轻链文库配对,构建成“人的增多,在抗体人源化改造时,可以根据人和鼠鼠杂合抗体库”,筛选与抗原结合的克隆,分离获CDRs间结构相似性选择人lg模板,挑选能支持移得人抗体的重链或轻链基因。再将它们与人的轻链植的鼠CDR与相应抗原结合的模板进行人源化改或重链文库混合,用抗原筛选,就能得到与抗原结造。最近,也有人提出框架改组( framework合的特异性人抗体。为了获得高亲和力的抗体,往shuffling)的方法进行抗体人源化改造,主要是往需要大容量抗体库。噬菌体抗体库需要通过生物将鼠抗体的6个CDR区以正确的读框融合到人Ig体转化。受转化效率的影响,一般库容不大。而核胚系框架中构建成库,用相应抗原筛库。由于筛出糖体展示技术不需要通过体内转化。因此,构建的的抗体框架来源于相匹配的CDR序列和结构,因抗体声中可筛选高亲和力此它保留了与抗原的最好结合,这种抗体接近于天抗体中国煤化工结构生物学、生物然的全人抗体。如果抗原也有晶体结构,则可以采信息CNMH体人源化的方法层用特异性决定基( specificity determining residues,出不穷。SDR)移植的方法2),该方法首先需要分析待改目前人源抗体的制备主要有4种技术:EB病造抗体的结合位点,或通过抗原-抗体复合物的三毒转化人B淋巴细胞、人x人杂交瘤技术、抗体医学分子生物学杂志,2006,3(4):245249 J Med Mol Biol,2006,3(4):245-249247库技术(包括噬菌体抗体库、合成抗体库、核糖行随机突变,然后筛选高亲和力的突变体。几种方体展示等)和转基因动物,有关内容已有多篇综法结合起来可以大大提高抗体亲和力22述2。据 DATAMONITOR分析,抗体产业化发23改进抗体的ADCC或CDC效应展趋势是:鼠源抗体到人-鼠嵌合抗体,到人源化在人类的效应细胞上,存在几种 FeaRs,它们抗体。特别是人源抗体,全人抗体的浪潮将在是FyRI(CD4)、FcyRⅡ(CD32)和FeyRⅢ2007年开始121。(CD16)。FYRⅡ和FyRⅢ还有A、B2个亚型。2如何提高抗体的效应功能FcyRⅡA有2个天然的同种异型,FyRⅢA有3个同种异型,不同的受体和它们的亚型与IgG的亲治疗性抗体的作用机制有多种,主要可归为两和力是不同的,触发抗体的效应功能也是不同的个基本类型:一类是依赖于它们的抗原结合功能,FRI以高亲和力结合lgG单体,而FRⅡ和例如抗体与抗原结合后阻断或中和靶分子的生物学FcRⅢ与LgG的亲和力较低,只能有效地与多聚活性、利用抗体的靶向性,将细胞毒性物质导向到免疫复合物反应。ADCC效应是通过抗体结合到靶部位、抗体与细胞膜抗原结合后诱发信号转导的NK、MΦ等效应细胞表面Fc受体上,激发吞噬作改变,引起细胞凋亡等;另一类除与它们的抗原结用或靶细胞裂解。而IgG与FyRs的相互作用依赖合能力有关外,还与抗体的Fc结构有关,如激发于Fe区域的寡糖及在铰链区和CH2区的某些氨基ADC和CDC效应,因此改进抗体与FcRs结合酸残基。最近报道从Fe的N-糖基化核上除去岩藻或与补体的结合,可以提高它们的治疗效果。针对糖,可以大大改善与FyRs的结合,促进ADCC活上述作用机制,对治疗性抗体进行改造2。性。低岩藻糖化的lgC显示增加与FcyRⅢA的1改变抗体分子大小结合,ADCC活性也提高。2001年, Shields等完整抗体的分子量在150ku左右,很难穿透对人 IgGI Fc与FyRs及各亚型的结合部位进行了血管进入实体瘤,而且从体内清除也慢,一些抗体突变分析,确定了在S298AE333AK334A3个位片段如Fab、单链抗体(ScFv)、 Dibody、 Minibody置上都突变的突变体与FcYRⅢA的结合增加,相由于去除了抗体的恒定区或Fe,因此在体内较快应的ADC活性也增加。该突变体去岩藻糖后被清除,有较好的肿瘤/血液比( tumor// blood rati-ADCC活性进一步增加,但这些均为体外实验结o),它们适合于放射免疫显像或放射治疗3。为果,尚未被体内实验证实。了增加抗体片段的稳定性,往往在轻、重链间引人CDC效应是依赖于补体成分Clqs与抗体铰链连接肽( linker)或二硫键。连接肽的长度和组成、区和CH2的结合,激发细胞的补体级联反应系统二硫键的位置需要通过计算机辅助设计确定,以减杀死靶细胞。lgG恒定区的定点突变和结构域转换少对抗体特异性、亲和力和表达量的影响。最近,研究结果表明:CH2结构域对CDC的功能是非常ablynx公司提出纳米抗体( Nanobody)的概念,重要的。据此, Indusogie等03用丙氨酸扫描突这是以骆驼抗体重链可变区为框架的抗体。它是人变技术研究了美罗华( Rituxan)的CDC功能,找gG分子的十分之一,稳定性好,制备容易。目前到CH2结构域中与Cq结合的位点Asp20,Lys2,已有3种纳米抗体正在进行临床试验23它们在空间结构上非常接近,进2.2增加抗体亲和力步又确定Clq结合区边缘的二个氨基酸Lys和对于治疗性抗体来说,抗体亲和力的提高有助Gu3,经改造可以增加与Clq的结合和CDC效于降低用量和毒副作用,此外也降低治疗费用。抗应。人Igl亚类在ADCC和CDC反应中是最有效体亲和力成熟常利用噬菌体展示( phage display)的,因此适合构建针对病原体和肿癬细胞的治疗性或酵母展示( yeast display)技术,基本上可以分抗体。而人IgG4不能激活ADCC和CDC,适用于为两大类:一类是通过构建CDR或可变区随机突显像诊断和阻断分子间相互作用。变的大容量库,然后筛选出高亲和力的突变体。也2.4改变抗体的药代动力学可以通过DNA改组( DNa shuffling)、链改组中国煤化工它与FeRn的结合( chain shuffling)).错配PCR等方法提高抗体亲和般CNMHG.4(血浆pH)时力;另一类是模拟体内亲和力成熟,构建集中突变不结合。通过对两者结合位点的研究,改造lgG上或热点突变的小容量库,也可以在6个CDR每个与FcRn结合的部位,使之在pH6.0时结合增加位置上进行单点突变,或在可变区的某些位置上进而不是在pH7.4。此外,Dl' Acqua等发现在Fe248沈倍奋.治疗性抗体的改造FcRn结合界面上252,254,256,433,434和436增加抗肿瘤效应。为了增强抗肿瘤作用,最近报道位引入突变能改善结合。Hnon等也发现TQ同时用2个不同的细胞因子,如I2和I-12,或和ML2个突变体分别使与FRn的结合增加3I4和GM-CSF,它们可以串联在抗体重链的C和7倍。同时突变2个地方,则结合增加28倍。端,或一个细胞因子融合在抗体重链或轻链的C在恒河猴体内,ML或TQML突变体显示血端,另一个融合在N端。体内外实验模型上显示浆半寿期增加2倍。改变抗体药代动力学的另一种出增加了抗肿瘤效果,但这么大的分子在体内能否方法是PEG修饰,它可以降低免疫原性、增加抗进人实体瘤还需要评价。最近报道细胞因子-抗体在体内的半寿期、提高稳定性、改变抗体的分布HER2融合蛋白在体内可以提高HER2胞外段蛋白(如:从血浆进入间质)组成的疫苗的反应,提示融合蛋白的一种新用2.5引入新的效应功能途裸抗体的效应功能是有限的,而且有些个体由于FyRs的多态性,对ADCC效应不敏感,因此需3抗体改造中几个有争议的问题要考虑通过交联或融合引人细胞毒性物质,例如:31鼠抗体人源化放射性同位素、药物、毒素、细胞因子等。已被治疗性抗体的免疫原性是影响它广泛应用和重FDA批准的 Mylotarg就是抗CD33抗体与 caliche-复应用的主要问题,但人源化程度达到多少算可mycin的交联物,用于白血病治疗,这种情况下抗以?全人抗体一定优于人源化抗体或嵌合抗体吗?体分子仅起靶向作用对此有不同的看法。 Clark等3对一些人源化抗体2.6双特异性抗体和全人抗体的序列进行分析,发现两者没有明显差双功能抗体可以结合2个不同的抗原表位,大异,而对人体的免疫原性是受很多因素影响的。除多数情况下是2个不同的抗原。早期的双功能抗体了可变区序列、I类型、抗体的糖基化情况外,抗原结合部位是针对肿瘤相关抗原,另一个是还有一些因素,如给药方式(静脉、皮下、肌肉靶向T细胞上的CD3分子或FcYR,促使免疫系统注射)、给药次数、给药剂量、患者状态、抗体特的效应细胞杀伤肿瘤细胞,例如:抗CD30×抗异性和靶抗原的性质等。这些影响抗体免疫原性的FeyRⅢ、抗CD30×抗FyRI双功能抗体治疗非因素要比Ⅴ区序列更重要。 Clark等同时指出,何杰金氏淋巴瘤,抗HER2×抗FyRI双功能抗身免疫病的存在说明人体免疫系统能对自身蛋白体治疗乳腺癌。最近又有一些新的双功能抗体出产生免疫反应,所以全人抗体完全不会产生免疫反现,它们一个结合部位是针对高亲和力的IgA应的推断是不正确的。 Hwang等收集了44个鼠FcaRⅠ,CD89),体内外实验结果显示:靶向抗体、15个嵌合抗体、22个人源化抗体和3个全FcRI不仅抗肿瘤的效果与FyRI双功能抗体一人抗体在人体上的免疫反应,以小于2%的人有反样好,而且对某些效应细胞(如粒细胞),FcRI应为可忽略( negligible)的免疫原性,以2%-15双功能抗体更有效3。%有反应为可耐受( tolerable)的免疫原性,大于2.7抗体-细胞因子融合蛋白15%有反应为显著( marked)免疫原性。接受鼠细胞因子能有效激活免疫细胞,如:单核细抗体的44人中84%有显著HAMA反应,7%的人胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、T细出现可耐受的免疫反应,9%的人不出现免疫反胞和B细胞。但同样会引起严重的副作用。如果应。在接受嵌合抗体治疗的15名患者中,有显著能将它们集聚在靶部位,就可以降低细胞因子治疗免疫反应是40%,可耐受的免疫反应是27%,33时的系统性毒副作用。抗体-细胞因子融合蛋白就%的患者没有免疫反应。在接受人源化抗体治疗的是利用抗体的靶向性达到上述目的的。各种细胞因22名患者中,9%有显著免疫反应,36%有可耐子可以连接到完整抗体或单链抗体的N端或C端。受的免疫反应,55%没有免疫反应。目前上市的抗体-Ⅱ2融合蛋白在小鼠模型上显示出抗各种肿全人抗体只有1个.但已经观察到有免疫反应出瘤的效果,不仅肿瘤缩小,而且能降低肿瘤转现中国煤化工非完全没有免疫原移。它们的抗肿瘤效应可能来自于浸润的效应性,CNMH例减少细胞的激活,如果存在 IgG Fc,则有可能通过细胞3.2抗体亲和力因子受体和FcYR,这样不仅细胞因子激活免疫细抗体亲和力是抗体的特性参数,从应用角度人胞,而且可同时提供FYR引起的ADCC,进一步们更关注抗体的亲合力( avidity)。亲合力很大程医学分子生物学杂志,2006,3(4):245249 J Med Mol 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