新型产乙醇重组菌利用葡萄糖和木糖的乙醇发酵

生产与科研经脸新型产乙醇重组菌利用葡萄糖和木糖的乙醇发酵孙金凤1,王正祥1(淮阴工学院生命科学与化学工程学院,江苏淮安,223001)2(江南大学,生物工程学院,江苏无锡,214036)摘要对构建得到的新型产乙醇重组菌JM09( pEtac-PA)、947( pEtac-PA)利用不同浓度葡萄糖或木糖的乙醇发畔进行了初步研究。结果表明,重组崮的乙醇发酵受到发酵碳源的类型、发酵液中糖浓度、发酵培养基的装液量、发酵液的pH值、重组菌的主类型等多种因素的影响,以野生型菌株E.coli947为宿主的重组曹947( pEtac-PA)发酵产乙醇的能力和乙醇得率均高于JMl09( pEtac-PA),尤其是在装液量加大、高浓度糖发酵以及利用木糖发酵时更加明显关键词产乙醇重组菌,乙醇发酵葡萄糖,木糖从2001年起我国开始进行乙醇汽油推广使用计1.1.1萬株与质粒划试点并已获得初步成功。2006年5月,国家发改重组质粒 pEtac-PA、E. coli jMI09、野生型菌委计划在原有的9个试点省基础上,将北京、上海、天株E.coli9473由江南大学生物技术重点实验室保津等中心城市纳入下一步推广范围。若以全国汽油存。以重组质粒 pEtac-PA转化E. coli JM109及野年消费量5000万t计算按照我国的国家标准,乙生型菌株E.coli947,在含有卡那霉素(Kan)的LB醇汽油中燃料乙醇占10%则需燃料乙醇500万t平板上筛选阳性转化子(实验操作参照文献进行),而实际上2005年我国的石油消费已经达到32亿得到重组菌JM109( pEtac-PA)、947( pEtac- PA)t)要消化粮食1000多万t。有不少专家担心,如果1.1.2培养基大规模用粮食生产燃料乙醇可能会影响我国粮食安发酵培养基釆用含有不同浓度葡萄糖、木糖或葡萄糖和木糖混合糖的LB培养基(重组菌的培养基中因此大规模的燃料乙醇生产要求开发丰富廉价添加Kan,终浓度为50g/mL)(,pH,.0左右。培的替代性原料,自然界中最丰富的碳水化合物木质纤养基中添加CaCO3时,添加的质量浓度为0.5%维素便是一种很好的替代性资源,利用木质纤维素1,2方法原料生产乙醇实现商业化的主要技术难题在于开发1,21乙醇发酵试验合适的菌种。传统的乙醇发酵工业所采用的酵母菌1.2.1.1三角瓶发酵和运动发酵单胞菌都不能发酵木糖或阿拉伯糖。自250mL三角瓶中装液量分别为20、100mL。挑然界的一些细菌虽能发酵五碳糖,但是其发酵产物中取相应菌株的单菌落接种于LB培养基中(重组菌的乙醇仅占很小的比例。人们通过代谢工程的手段构培养基中添加Kan),37℃0,200r/min振荡培养过夜建能发酵六碳糖和五碳糖的产乙醇优良重组菌,使之作为种子液,接种量为2%,接种后,37℃、200min能够发酵葡萄糖、木糖或者阿拉伯糖产生酒精。组质粒 pEtac振荡培养过夜然后静止发酵。采用IPTG诱导时IPTG添加量为100g/mL,在振荡培养后期加人,诱PA转化 Escherichia coli jM109及前期研究中筛选得到的野生型菌株E.coli9473得到新型产乙醇导2h1.2.1.25L发酵罐发酵重组菌JM109( pEtac-PA)、947 pEtac-PA),本文对重组菌的乙醇发酵进行了初步研究。采用KF5L发酵罐(韩国发酵机株式会社)对重组菌947-( pEtac-PA)的乙醇发酵进行初步放大试1材料与方法验,培养基装液量为3L,接种量为2%添加0.5%1.1材料CaCO3,发酵温度37℃,接种后先通无菌空气并搅拌(转速为460/min)以增加溶氧便于菌体的大量增第一作者:硕士,副教授殖,然后停止通氧搅拌,静止发酵。教育部骨干教师资助项目(No.1696)收稿日期:2006-10-181.2.2乙醇含量测定采用气相色谱法(1490气相色谱仪,安捷伦科技20年第34卷第5则(总第245周)105食品与发断工业 OOD AND FERMENTATION INDUSTRI图上海分析仪器有限公司)测定,色谱参数为:进样温度的乙醇发酵200℃,检测温度200℃,柱温140℃。2m不锈钢柱2.1.1装液量为20mL时,重组菌JM109( pEtac-(内径3mm),采用沪产401白色有机担体。载气PA)利用5%葡萄糖的乙醇发酵(N2)压力0.2MPa,H2压力0.10MPa,空气0.2同样条件下对重组菌JM109( pEtac-PA)及其宿MP主菌E. coli jM109(作为对照)的乙醇发酵进行了研1.2.3pH值测定究。如图1所示,重组菌JM09( pEtac-PA)的耗糖采用320-SpH计( METTLER TOLEDO公主要发生在发酵前期的24~36h,耗糖的同时伴随司)测定着乙醇产量的增加。发酵初期菌体大量增殖,重组菌1.2.4糖浓度测定JM109 pEtac-PA)最终达到的菌体浓度(OD0m葡萄糖浓度测定采用SBA生物传感分析仪(山6.734)明显大于宿主菌E. coli JMI09(OD=4.东省科学院生物研究所测定。木糖浓度测定采用苔0),发酵前期发酵液的pH值显著下降,到发酵后期黑酚法。。基本保持稳定,说明酸的产生集中在发酵前期,可能1.2.5细胞密度测定是由于发酵初期菌体大量生长增殖需要消耗大量氧在600nm波长下进行光电比浊测定,用吸光度气,造成供氧不足糖代谢的产物中就会有较多酸产值OD大小表示细胞密度的高低生口。在发酵液中添加CaCO2可以部分中和发酵过2结果与分析程产生的酸,维持发酵液较高的pH值(始终在pH6以上)(图1A)。2.1量组菌JM109( pEtac-PA)利用葡萄糖和木糖pH值值葡萄梯浓度隔细胞密度葡暫嘁掖度(%)一乙醇浓度隔pH值(加 Caco)乙醇浓度(%)葡萄糖浓度(加caCO)乙醇浓度(加CaCO)204060发酵时间/h发酵时间/hA)JMIO9(PEtac-PAB)Ecl M1o9图1重组菌JM109( pEtac-PA)及其宿主菌E. coli JM109乙醇发酵过程乙醇浓度、pH值、葡萄糖浓度及细胞密度(以ODm表示)的变化宿主菌E. coli JM109发酵5%葡萄糖仅能产生下降较小,乙醇产率高。极微量的乙醇(0.04%,乙醇浓度为体积分数,下同),2.1.2装液量为20mL时,JM109( pEtac- PA)利用如图1B;而重组菌JM109( pEtac-PA)发酵5%葡萄5%木糖的乙醇发酵糖48h达到最大乙醇产率,为1.89%,显著高于其宿为了确定重组菌JM109( pEtac- PA)的乙醇发酵主菌证明该重组菌中成功引人了乙醇生物合成途是否受到IPTG诱导作用的影响,在进行5%木糖的径。若在发酵液中添加CaCO3,重组菌发酵24h左乙醇发酵试验时对于IPTG诱导和不诱导条件下的右即可达到最大乙醇产率1.92%,为理论转化率(1乙醇发酵结果进行了比较。添加IPTG诱导时,g葡萄糖可产生0.51g乙醇)的59.5%。CaCO3的JM109( pEtac-PA)利用5%木糖发酵36h达到最大添加使得发酵时间显著缩短,可能是由于加入的Ca乙醇产率(仅为0.35%),残留的木糖为3.25%;而同CO3部分中和了发酵产生的酸使得发酵液pH值相样条件下不加诱导物IPTG时,发酵36h达到最大对稳定,对菌体生长有利,菌体浓度高则产乙醇能力乙醇产率为1.78%为理论产率的55.2%。结果表大明,添加IPTG诱导pdc、adhB基因的表达,乙醇产对照乙醇发酵过程菌体浓度、乙醇产率、pH值率反而较低。这一结果进一步说明了pdc、adhB基及残糖的变化可以发现,JM109( pEtac- PA)比其宿主因的表达量太高反而不利于乙醇的产生,与以前的研菌E. coli jM109的最终菌体浓度大,残糖低,pH值究结果一致(2.因此在进一步的发酵试验中不添加105|2003No5(oo25产与科研经验IPTG诱导。0.21%,残留木糖3.21%(图2C),发酵10%葡萄糖21.3装液量为100mL时,JM109( pEtac-PA)利用36h达到最大乙醇产率3.4%残糖为1.6%(图葡萄糖和木糖的乙醇发酵2D)。结果同样表明,乙醇发酵时重组菌优先利用了装液量为100mL时,JM109( pEtac-PA)发酵混合糖中的葡萄糖。5%葡萄糖48h达到最大乙醇产率(为0.825%),残2.2.2装液量为100mL时,947( pEtac-PA)利用葡糖2.9%。发酵5%木糖48h时达到最大乙醇产率萄糖和木糖的酒精发酵(为0.7%),残糖为3.12%。利用5%葡萄糖和5%装液量为100mL时,947( pEtac- PA)利用5%葡木糖的混合糖发酵48h达到最大乙醇产率为萄糖发酵36h达到最大乙醇产率2.83%残糖为0.764%残留的葡萄糖和木糖分别为3%和444%。0.22%。发酵5%木糖36h达到最大乙醇产率为发酵10%葡萄糖,36h时乙醇产率仅为0.918%,残2.22%,残糖为0.6%。发酵5%葡萄糖和5%木糖糖为7.65%;发酵48h时残糖仍高达7.35%的混合糖36h达到最大乙醇产率为2.43%残留的由以上结果可以看出,利用葡萄糖和木糖混合糖葡萄糖和木糖分别为0.83%、4.15%。发酵10%葡的乙醇发酵过程中重组菌优先利用了混合糖中的葡萄糖48h达到最大乙醇产率为3.12%残糖为3.萄糖。有资料报道戊糖发酵微生物会优先利用己糖7%。结果表明装液量加大时947( pEtac-PA)的乙和戊糖混合物中的己糖,因此如果发酵时间不足则醇发酵结果与装液量为20mL时差别不太大。乙醇戊糖会有残留。试验结果与资料报道一致。在装发酵结果均好于同样条件下JM19( pEtac-PA)的乙液量加大为100mL时乙醇产率降低,残糖较高,这醇发酵。这可能是由于野生型菌株生长速度快,可以可能是由于装液量加大后溶氧效果差导致菌体量不达到较大的菌体浓度。另外发酵培养基中糖浓度升足而影响乙醇的产率。此外,发酵培养基的糖浓度升高时残糖也较高,乙醇得率降低说明由野生型宿主高,发酵产乙醇的产率降低,残糖高这可能是由于细菌构建得到的产乙醇重组菌的乙醇发酵同样受到高菌耐受高渗透压环境的能力比传统的酒精发酵酵母浓度糖的抑制。弱,高浓度糖所造成的高渗透压环境对细菌的生长不2.2.3重组菌947( pEtac- PA)的乙醇发酵初步放大试验2.2重组菌947{ pEtac-PA)的乙醇发酵采用5L发酵罐对重组菌947( pEtac-PA)的乙2.2.1装液量为20mL时,947( pEtac-PA)利用葡醇发酵进行初步放大试验。结果表明,947( pEtac-萄糖和木糖的乙醇发酵PA)发酵5%葡萄糖达到最大乙醇产率(2.07%)如图2所示,培养基中不加CaCO3时,947发酵10%葡萄糖48h产生2.8%乙醇。发酵5%木( pEtac-PA)利用5%葡萄糖发酵36h达到最大乙醇糖48h产生1.22%乙醇。发酵5%葡萄糖和5%木产率1.86%而添加CaCO3时发酵24h达到最大乙糖的混合糖48h产生2.15%乙醇。5L罐乙醇发酵醇产率1.96%(图2A)。添加CaCO3时947( pEtac初步放大试验的结果表明,947-( pEtac-PA)的乙醇PA)发酵5%木糖24h达到最大乙醇产率2.21%,产率比三角瓶发酵有所降低。可能是由于根据三角而不加CaCO3时发酵36h仅产生1.91%乙醇(图瓶发酵而确定的初步放大试验的发酵条件并不适用B)。这一结果进一步说明,在发酵培养基中添加于发酵罐试验如溶氧可能不足导致菌体浓度低,且CaCO2可以显著缩短发酵时间。同时也说明了发酵发酵副产物增多等等液pH值的降低对乙醇发酵有很大影响。因此在进3讨论步的乙醇发酵试验中,发酵培养基中均添加CaCO3。在同样条件下,宿主菌E.coli947分别利用研究结果表明,引入pdc、adhB基因的重组菌5%葡萄糖和5%木糖的乙醇发酵结果显示,E. coli JMI09( pEtac-PA)能够有效利用葡萄糖发酵产生乙947只能产生极微量乙醇(分别为0.02%和醇,发酵5%葡萄糖36h可产生1.8%乙醇,而宿主菌0.46%),说明重组菌947( pEtac-PA)中乙醇生物合E. coli JM109发酵葡萄糖仅能产生极微量的乙醇成途径成功引入同样条件下野生型宿主菌E.coli947仅能产生极947( pEtac-PA)发酵5%葡萄糖和5%木糖的混微量的乙醇而重组菌947( pEtac- PA)可以有效利用合糖36h达到最大乙醇产率2.76%,残留葡萄糖葡萄糖、木糖发酵产生乙醇证明乙醇生物合成途径280年第34卷第5(总第245期)107食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES一不加碳酸钙一不加碳酸钙口添加碳酸钙加碳酸钙酵时间/h发酵时间/h(A)5%葡萄糖(B)5%木糖-乙醇浓度(%)一乙醇浓度(%-pH值口pH值葡萄浓度(%)葡萄浓度(角)发酵时间/h发酵时间/h()5%葡萄糖+5%木糖D)I0%葡萄糖图2重组菌947( pEtac-PA)利用葡萄糖和木糖的乙醇发酵结果在宿主菌E. coli jM109、947中成功引入(2207%。资料表明,合理的发酵工艺控制可以给微生根据本研究结果,乙醇发酵过程中发酵培养基的物提供良好的环境,提高目标产品的生产水平,同时装液量、发酵碳源的类型、发酵培养基中糖浓度、发酵减少不需要的特别是有害的代谢副产物的积累。基培养基的pH值、重组菌的宿主类型等因素均对乙醇因工程菌在构建时,通常都是采用摇瓶培养的方法比产率具有一定影响。发酵过程中发酵液pH值的降较其生产能力这样得到的培养工艺一般并不直接适低对于乙醇产率影响显著。在发酵液中添加CaCO3,用于发酵罐,而且摇瓶的操作方式和提供的培养环境可以部分中和发酵产生的酸维持发酵液的pH值相与发酵罐有很大的差别。因此对基因重组菌进行深对稳定,有利于菌体生长,因而可以显著缩短发酵时的发酵特性研究,对发酵过程加以优化,可以充分间。在装液量加大时乙醇产率降低。同样装液量时,发挥其生产能力0。因此对本研究中采用的新型产糖浓度提高乙醇产率降低。发酵液pH值的降低、乙醇重组菌的乙醇发酵工艺参数进行优化,有望进一装液量加大(溶氧效果较差)、糖浓度提高(渗透压增步提高其乙醇产率。大)最终都使得乙醇产率降低,原因可能是这些因素都会影响菌体的生长,导致菌体浓度降低。以野生型考文谳菌株E.coli947为宿主的重组菌947( pEtac-PA)发1孙金风诸葛健,王正祥.重组肠道细菌作为产乙醇生物催酵产乙醇的能力要高于以E. coli JM109为宿主的化剂的研究进展[],工业微生物200,34(3):44~48JMo9( pEtac-PA),尤其是在装液量加大高浓度糖2孙金风,徐敏,张峰,等,利用木糖和葡萄糖合成乙醇的新发酵、以及利用木糖发酵时更明显。这可能是由于野型重组大肠杆菌的研究[J].微生物学报,2004,44(5);600~604生型菌株生长速度较快,可以达到较大的菌体浓度3孙金风诸葛健,王正祥有效利用木糖的肠道细菌的筛从而乙醇产率高。无论是重组菌JM09( pEtac- PA选,无锡轻工大学学报[].2003,22(1):21~24或947( pEtac-PA)利用葡萄糖和木糖的混合糖进行4(美)萨姆布鲁克J拉塞尔著DW.黄培堂等译分子发酵时,菌株均优先利用其中的葡萄糖,与资料报道克隆实验指南(第三版M].北京:科学出版社,2002.96~99,159重组菌947( pEtac-PA)的5L发酵罐乙醇发酵初5宁正样主编食品成分分析手册[M]北京;中国轻工业出步放大试验结果要逊色于三角瓶发酵。三角瓶发酵版社,1998.21时(装液量为100mL),947( pEtac-PA)发酵5%葡萄6沈萍范秀容李广武主编微生物学实验(第三版[M]北京:高等教育出版社,1999.97~99糖最大乙醇产率为2.83%。而上罐发酵时,9477 Ingram L O, Conway T. Expression of different levels of( pEtac-PA)发酵5%葡萄糖的最大乙醇产率为ethanologenic enzymes from Zymomonas mobilis in recom108208vol34No5(o|245)binant strains of escherichia coli[. Appl Environ Micro9沈萍主编微生物学[M]北京:高等教育出版社,200080biol,1988,54(2):397~404~818 Olsson L, Hahn-H Gerda B. Fermentation of lignocello10李育阳主编.基因表达技术[M].北京:科学出版社,ndJ]. EnzymMicrobial Technol, 1996, 18: 312-331Ethanol Production of Novel Ethanologenic RecombinantEnteric Bacteria from Glucose and XyloseSun Jinfeng, Wang Zhengxiang1(School of Life Science and Chemical Engineering, Huaiyin Instititute of Technology, Huaian 223001, China)2(School of Biotechnology, Southern Yangtze University, Wuxi 214036, China)aBSTRAct In this article, ethanol production of recombinants E. coli JM109(pEtac-PA)and E. coli 947(pEtac-PA)at different concentrations of glucose and xylose or mixture of glucose and xylose was studiedResults indicated that E. coli 947(pEtac-PA)was efficient for ethanol fermentation from glucose and xylose.Fermentation was completed in 36h and the maximum ethanol yield were 87. 4% and 68. 7% of the theoreti-cal, respectively, which were both much better than that of E. coli JM109(pEtac-PA). Ethanol productionof the recombinants was influenced by various factors such as carbon source, sugar concentration, pH value,host type of the recombinants, etc.Key words ethanologenic recombinants, ethanol fermentation, glucose, xylose2009年讪国际烘焙糖果巧克力及糕点博览会北京新闻发布会召开2008年5月13日,2009年iba国际烘焙、糖果、巧克力及糕点博览会北京新闻发布会在北京皇家大饭店举行国联邦烘培业联合会(ZVB)主席 Peter Becker先生、德国暾邦烘培业联合会(ZVB)董事总经理 Eberhard Groebel博士、德国手工业博览会公司(GHM)董事会主席Mr. Raisbeck先生分别致辞,b是国际领先的烘焙、糖果及咖啡食品业易展会.60年来3年一届的iba一直不断拓展其领导地位,上届于2006年ba在基尼展举行期间共吸引来自144个国家的800观众及1000家来自世界各地的参展商,ba209将于200年10月3~10日在杜骞尔多夫举行ba展品范围:从零部件到成銮生产线等各类最新设备、机械于设施;冷藏、发酵与空调最新技术;各类原材料;IT硬件与件;卫生设备与产品;零食小吃;咖啡相关设备与产品;资格认证相关产品与服务,ba巢力服务所有规模的企业,它不仅适合工业辗生产企业,各类中小型企业也能从中获取许多的发展助益,如有要求,iba可考虑合作举办相关展期特别活动2009将在展览同期举办一系列研讨交流活动,其中包括研讨论坛、 iba Cup、薨国烘焙学会研讨会和杜塞尔多夫地区烘焙厂作为iba2009的主办机构,德国联邦烘焙业联合会( Central Association of German Bakers)将举办主题广泛的教育活动,向来自世界各地的观众介绍烘焙技术、质量管理及市场推广等各方面的发展现状,致力提升业界经营水平为满足旺盛的海外需求擲国联邦烘培业联合会在德国烘业学院下设了国际烘榕学院(IBA).BA将为个别学员团体提供具有直接针对性的研讨培训课程,并通过专业翻译确保德烘塘专业技术的准确传达.这些塘训项目并非只面向世界各地烘与糖果行业的协会、组织和技术学院,同时还可为企业的合资格员工提供针对性的服务。而且,在达成道当协议的情况下,国际烘培学院(IBA)专家还可在其国家举办这类研讨塘训活动,学员在完成培训课程后可获得学院颁发的资格证书(参见www.akademie-baeckerhandwerk,del),敬进-岁了解以上提到的教育墙训课程,请光临在i:200的“ZentralverbanddesDeutschen BA ckerhandwerks”展位2009年第34卷亮5用(总莞245)109