Gas7在大鼠关节软骨中的表达及意义

第18卷第2期中国组织化学与细胞化学杂志Vol. 18. No.22009年4月CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISIRY AND CYTOCHEMISTRYApr. 209Gas7在大鼠关节软骨中的表达及意义李金生王建超"解杰陈华刘俊2王小丽’刘胜洪'(华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科;'华中科技大学同济医学院组织胚胎教研室;武汉430030;2华中科技大学同济医学院附属协和医院外科，武汉430022)[摘要]目的 探讨生长体止蛋白 7 (Gas7)在成年大鼠关节软骨中的表达及意义。方法雄性 SD大鼠(3个月、12个月)各12只取膝关节和股骨上端关节部分，经脱钙石蜡包埋并切片，采用HE染色和免疫组化SABC法检测。检测各关节软骨组织中Gas7的表达及其定位。结果关节软骨切线层与移行层Gas7的表达呈现强阳性，而在辐射层及软骨钙化层则弱阳性或阴性。结论Gas7 在成年大鼠关节软骨各层细胞的表达不同，可能与各层软骨细胞的生长发育及代谢状况有关[关键词]生长休止蛋白7; 关节软骨[中圈分类号] R322. 71[文献标识码]1DOI: 10. 3870/zgzzhx 2009. 02. 020EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF GAS7 IN THE ARTICULAR CARTILAGE OF RATSLi Jinsheng, Wang Jianchao" ，Xie Jie, Chen Hua, Liu Jun2，Wang Xiaoli' , Liu Shenghong'(De partment of Orthopadics of Tongji Hospital ;' Department of Histology and Embryology,Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430030;2Department of Surgery , Union Hospital , Wuhan 430022, China)[Abstract]Objective To explore the expression and the effect of Gas7 in the articular cartilage of a-dult rats (aged 3 or 12 months)。Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression ofGas7 in the articular cartilage of rat long bones. Results The expression of Gas7 was positive in the tangen-tial zone and the transitional zone of the articular cartilage of matured rats. The expression of Gas7 in theradial zone and the calcified cartilage zone was weakly positive or negative. Conclusion The diversity ofGas7 expression in different zones of rat articular cartilage may be related with the growth, developmentand metabolism of chondrocytes.[Key words] Growth arresting specific protein (Gas) 7; Articular cartilage1988年Schneider等首次从小鼠成纤维细胞中参与了调控胚胎干细胞(embryonic stem cell,分离出生长休止蛋白(growth arresting specificESC)的倍增过程[6]。尽管在Gas7在神经组织，protein GAS )印,其后的研究发现GAS基因参与血液和肿瘤等方面有较多的文献报道，而作为分化机体多种细胞活动，具有较广泛的生物学功终末细胞之一的关节软骨细胞中，有无Gas7表能L.3.4]。Gas7 是GAS家族中的一个亚型，于达，目前尚不明确。本实验拟通过免疫组织化学方1998年从小鼠无血清培养的成纤维细胞中首次分法，显示Gas7在成年大鼠关节软骨细胞中的表达离出来，它主要表达在分化终末细胞，如神经细及定位，为进一步揭示Gas7对分化终末细胞的作胞，周围血细胞等5。它可抑制肿瘤细胞生长，使用机制，以及研究关节软骨生长发育、损伤和修复之向正常方向分化，促进神经发育分化过程。提供依据。Moorthy等在实验中发现细胞受损时，Gas7 可能中国煤化工[收稿日期] 2008-04-13 [修回 日期] 2008-09-20YHCNMHG龄、12月龄各12[作者简介]李金生，男(1974年),汉族，硕上研究生。只(同济医学院实验动物学部提供)，体重250-*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)第2期李金生等. Gas7在大鼠关节软骨中的表达及意义223400g。经4%多聚甲醛心脏灌注后，取大鼠膝关节相对较薄，细胞数目较少，辐射层与钙化层之间未和股骨.上端关节部分，后固定6小时，经10%ED-见明显的潮线形成，干骺端的骺板较厚(图A,TA脱钙10-14d、酒精脱水、石蜡包埋、切片。C)。12 月龄大鼠关节软骨的表层、移行层、辐射2. SABC免疫细胞化学反应:切片脱蜡至水后层分层不明显且厚度较3月龄组薄，细胞数目相对部分行HE染色透明封片;部分经300mg/L H2(h要少。在辐射层与钙化层之间可见多条潮线形成,10min;正常牛血清封闭，37C30min;兔来源干骺端骺板与干骺端相融合(图B, D)。anti- Gas7 (1: 100) 37C 2h后室温过夜，再37"CSABC法染色结果见3月龄组大鼠关节软骨切2h;生物素标记的羊抗兔抗体IgG (1 : 300,北京线层、移行层的软骨细胞中Gas7表达呈现强阳中杉金桥生物技术有限公司) 37C孵育1h; SABC性，辐射层软骨细胞偶见阳性表达，钙化层和干骺复合物37C孵育1h; DAB显色，8-10min, 终止端骺板的软骨细胞则为阴性表达，各阳性细胞主要反应。苏木素精复染后切片经酒精脱水，二甲苯透表达于胞浆中，少数细胞在胞核中同时也呈阳性表明，树胶封片。显微镜下观察。达(图E, G)。12 月龄大鼠关节软骨细胞Gas7表达结果与3月龄相似，在切线层、移行层软骨细胞果中呈现阳性表达，辐射层可见少数细胞弱阳性表HE染色见3月龄大鼠关节软骨的表层、移行达，而钙化层和干骺端骺线区的软骨细胞未见细胞层、辐射层各层分层明显，细胞数目较多，钙化层阳性表达(图F. H).G图A、B为3月龄、12月龄大鼠正常关节软骨组织。HE染色X200图C、D为3月龄大鼠骺板和12月龄大鼠骺线区组织。HE染色X200.图E. F为3月龄、12月龄大鼠正常关节软骨细胞Cas7表达。X200图G、H为3月龄大鼠骺板和12月龄大鼠骺线K软骨细胞(ias7表达。X200.Fig.A. B The articular cartilage tissue of rat (3 month, 12 month) . HE staining X 200Fig.C、D The epiphyseal plate of rat (3 month, 12 month) . HE staining. X200Fig.E. F The articular carilage tssue of rat (3 month. 12 montl中国煤化工Fig.G. H The epiphyseal plate of rat (3 month, 12 month), GaYHCNMHG224中国组织化学与细胞化学杂志第18卷细胞活性的标记作用(marker), 它对于判定关节讨论软骨不同层次内细胞的机能状态可能具有意义。Gas7在骨细胞或关节软骨细胞的定位研究目成年体内的软骨组织是一-种较特殊的组织，损前尚未见报道。本实验首次观察到Gas7在关节软伤或退化后一般不能再生。本实验初步观察了骨中的表达主要位于成年大鼠关节软骨表层与移行Gas7在关节软骨中的表达及定位特征，但关于层细胞，在辐射层也有少许细胞呈弱阳性表达，但Gas7对关节软骨的正常生理或病理方面存在的影在软骨钙化层及断板处则呈阴性表达。响及机制，仍有待进-一步研究。关节钦骨主要由大量细胞外基质与散在分布其参考文献中的高度特异性细胞(软骨细胞)组成。从关节钦骨表而至软骨下骨，关节软骨的结构呈分层变化,[1] Schneider C, King RM, Philipson L Genes seifially主要表现在细胞的形状与大小，胶原纤维的粗细与expressed at growth arrest mammalian cells. Cell,走向，蛋白多糖的浓度及水含量多少等。关节软骨1988，54 (6): 787-793其表面向下可被分成四层:切线层、移行层、辐射[2] Brancolini C, Bottega S, Schneider C. Gas2, a growtharrest-specific protein, is a component of the microfila-层、钙化软骨层。钦骨细胞叮以对许多环境刺激产ment network system. J Cell Biol, 1992, 117 (6);生反应，包括可溶性调节因子，如:生长因子、白1251-1261细胞介素、药物;基质分子;机械负重;流体压力3] Zoidl G, Blass- Kampmann S, D'"Urso D, Schmalenbach的变化等[6,7,8]。Yang Xia等研究发现在某些关节C, Muller HW. Retroviral-mediated gene transfer of软骨中央，可以观察到明显软骨分层现象，即上述the peripheral myelin protein PMP22 in Schwann Cell:表层等四层;然而，在关节的周边区发现更复杂的modulation of cell growth. EMB3O J, 1995, 14 (6):多层次软骨区，如在关节软骨组织杀层的周边区发1122-1128现了类似切线层和移行层存在[9]。这些实验结果表[4] Lih CJ, Cohen SN, Wang C, Lin-Chao S The plateletderived growth factor alpha-receptor is encoded by a明关节软骨形成和分化的复杂性。growth arrest specifie (gas) gene Proc Natl Acad Sei作为特异性表达于细胞分化终未期(G0期)USA, 1996, 93 (10); 4617-4622的蛋白质5，Gas7具有抑制细胞繁殖分裂促进细[5] Ju YT, Chang AC, She BR, et al. Gas7: A gene ex-胞进一步分化成熟的功能。本实验中也发现在细胞pressed preferentially in growth arrested fibroblasts and增殖分裂明显的骺板区软骨细胞Gas7表达呈阴terminally differentiated Purkinje neurons affects neurite性，而在细胞停止增殖分裂、细胞分化成熟明显的formation. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95 (19);成年大鼠关节软骨区域软骨细胞为阳性表达，提示11423-11428Gas7的表达与软骨细胞的成熟或分化状态有关，[6] Moorthy PP, Kumar AA, Devaraj H. Expression of但其机制仍不清楚。Wong等观察到，关节软骨表the Ggas7 and Oct4 in Embryonic Sterm Cells of mice.Sterm cells Dev, 2005, 14: 664-670面所受物理因素的不同可以影响软骨细胞形态的分[7] Chao CC, Su LJ, Sun NK, et al. Involverment of Gas7化、成熟或退化，甚至可以表现为--系列的基因上in nerve growth factor-independent and dependent cell调或下调[0]。Hayes 等观察从幼年到成人关节软processes in PC12 cells. J Neurosci Res, 2003, 74:骨的形态转变过程中发现各层软骨细胞的分裂周期248-254不同，与移行层相比，表层软骨细胞的分裂周期较[8] Joseph A, Buckwalter MD, MS Thomal A, et al,陈短叫。此外，他们也研究发现，随着次级骨化中启明等泽，骨科基础科学(骨关节肌肉系统生物学和心的形成，TGF- (逐渐分布到关节软骨的切线层生物力学第二版) . 北京:人民卫生出版社，2001与移行层，说明内源性因子对机体关节软骨的生长C9] Xia Y, Moody JB, Alhadlag H, et al. Imaging the发育产生- -定影响11。physical and morphological properties of a muliZoneYoung articular cartilage at microscopic resolution. J根据上述报道，结合本实验结果分析，我们推Magn Reson Imaging, 2003, 17 (3): 365-374测Gas7在成年大鼠关节钦丹各层细胞表达的差异[10] Wong M，Carter DR. Articular cartilage functional性，或许与关节所受物理因素影响有关，使基囚表histomorphology and mechanobiology: a research per-达发生变化，导致Gas7在成年大鼠关节软骨各层spective. Bone, 2003, 33 (1); 1-13细胞表达不同，从而关节软骨细胞发生结构变化。[11) Haves AJ, Macpherson S, Morrison H, et al, The de-此外由于关节软骨的辐射层和钙化层细胞逐渐肥artirunlar artilape. evidence for an appo-大、退化，而在此区域内的软骨细胞Gas7表达是中国煤化工at Embryol (Berl),弱阳性或阴性，因而提示Gas7可能具有显示软骨YHCNMHG