聚乙二醇修饰水蛭素的分离纯化与活性分析

药物生物技术302Pharmaceutical Biotechnology 2004,11(5) :302 ~305聚乙二醇修饰水蛭素的分离纯化与活性分析于爱平,蒋中华,钟根深,董春娜,吴祖泽'(军事医学科学院放射医学研究所,北京100850)摘要用活化的聚乙二醇(PEG)对水蛭素进行化学修饰,质谱分析表明,修饰产物是修饰度不同的分子质量相差5 000 u的水蛭索的混合物。用离子交换层析和凝胶过滤层析对反应产物进行分离纯化,离子交换层析难以达到完全分离;而采用凝胶过滤层析方法可较好地分离修饰度不同的各组份。生物学活性分析表明,不同的PEG修饰度对水蛭素的活性具有显著影响,连接1~2个PEG的水蛭素保持了原有活性,而连接3个PEG的水蛭素活性显著下降。关键词水蛭素 ;聚乙二醇;化学修饰;分离纯化中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号: 1005-8915(2004)05 0302-04血栓疾病已成为威胁人类健康最严重的疾病之物的活性进行研究具有重要意义[7.8]。一,在该类疾病的治疗过程中,除了使用溶栓药物采用PEG对水蛭素进行化学修饰,是延长其外,通常还需要使用抗凝药物以提高疗效和防止再半衰期降低其免疫原性的有效方法。本研究建立栓塞。凝血酶在血凝系统中参与凝血过程的共同途了PEG修饰水蛭素的分离纯化方法,并对水蛭素径,水蛭素(hirudin)可通过与凝血酶的结合直接抑的不同修饰度对其活性的影响作了探讨。制凝血酶的活性,从而具有抗凝和抗栓作用,目前被1材料和方法认为是凝血酶最强的抑制剂。水蛭素是一- 种小分子(7ku )的蛋白,在体内的消除半衰期只有1~ 1.1 实验材料2 h1.2 ,临床用药量较大。此外,连续使用大剂量异mPEG- SPA(分子质量5 000 u)购自Shearwater源蛋白,临床免疫反应常常限制了其有效应用。公司;重组水蛭素I为本实验室提供,纯度95%以为了提高和改善蛋白和多肽药物的药效学和上;凝胶过滤介质Superdex75和离子交换介质药物动力学特性,采用- - 些化学材料对药物分子进SourceQ15均购自Pharmacia 公司; TH发色底物购行化学修饰是实现这一目标的重要途径之一。自Roche公司。其他药品为分析纯。所有水溶液均PEG修饰后的蛋白不容易被蛋白水解酶降解，而用Millipore超纯水系统生产的超纯水配制。且不容易被肾小球滤过,所以血药半衰期得以延1.2 mPEG SPA修饰水蛭素的制备长3.4]。同时, PEG对蛋白抗原表位的物理屏障作水蛭素溶于pH值9的硼酸缓冲液中,分别按用,可以使蛋白的免疫原性或抗原性下降或消水蛭素:mPEG-SPA摩尔比1:1和1:2的比例称除5]。其中,PEG修饰的腺苷脱胺酶和天冬酰胺取mPEG SPA,室温搅拌反应1 h。酶已获批准上市6]。一定种类的活化好的PEG对1.3 质谱分析蛋白质的特定基团有一定的选择性,但对某- - 蛋白取水蛭素与mPEG SPA摩尔比为1:2的反应产分子内的多个相同基团的修饰却具有随机性,产物物,质谱方法(MALD-TOF-MS)测定产物分子质量。因修饰程度和修饰位点的不同而存在不均一-性,产1.4 离子交换层析物的活性也随之不同。因此，研究PEG修饰后的取水蛭素与mPEG- SPA比例为1:1的反应产蛋白质产物的分析与分离方法并对不同修饰度产=X 10 cm),流动相A中国煤化工fHCNMHG收稿日期:2003-11-25修回 日期:2004 -01-09基金项目:国家“973”计划基金(2002CB7 13804)资助作者简介:于爱平,1972年生,女,山东省海阳市人,在读博士生E-mail:yap7020@ sina. com. cn*通讯作者:吴祖泽Tel:010-68158311 E-mail: wuct@nic. bmi. ac. cn于爱平等;聚乙二醇修饰水蛭素的分离纯化与活性分析303液:0.02 mol/L的乙醇胺缓冲液(pH值9.5),B2.2离子交换层析液:0.02 mol/L的乙醇胺缓冲液(pH值9.5)加首先,采用离子交换层析方法对修饰混合物进0.5 mol/L的NaCl。0~0. 5 mol/L NaCl线性梯行了分离尝试，分别取各洗脱峰进行SDSPAGE。度洗脱，流速为2 ml/min,检测波长为214 nm。从色谱图(图2)和电泳图(图3)可以看出,不同修1.5 凝胶过滤层析饰度的PEG水蛭素的保留时间存在差异。图2中取水蛭素与mPEG -SPA比例为1:1的反应产峰1,峰2和峰3分别为接3个,2个和1个PEG物上Superdex 75柱(2.6 cmX 90 cm),流动相为的水蛭素,峰4和峰5又分别是接2个和1个PEG0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH值7.0),流速为的水蛭素。但不同修饰度的PEG-水蛭素仍然难2ml/min,检测波长为214nm。以达到基线分离,通过改变洗脱条件并没有明显1.6 生物活性测定改善。参照文献[9]的方法,取凝胶过滤层析中分得的各组份,按等摩尔数水蛭素测定其生物活性。31.7 蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE方法)按文献[10]方法进行,采用氯化钡和碘液对PEG进行染色,水洗后再对蛋白进行考马斯亮蓝染色。2.结果2.1 反应产物分子质量6120 180 240 300 360Elution volume(m)由质谱图(图1)可看出,连接产物中有5种成分,其分子质量依次相差5 000 u左右,该分子质量Fig2 Chromatograph of PEGylated hirudin isolated withanionrexchange chromatography之差与所用PEG分子质量-致,由此可知,分子质量由小到大分别对应于水蛭素和连接1,2,3,4个123PEG的水蛭素(分别记为水蛭素、PEG1-水蛭素、PEG2水蛭素、PEG3-水蛭素和PEG4-水蛭素)。因此,PEG修饰水蛭素的产物是不同修饰度产物的混合物。采用HPLC分析各修饰组份的百分比,其中PEG1-水蛭素、PEG2水蛭素、PEG3-水蛭素和PEG4-水蛭素百分比分别为10.1%, 32. 1%，42. 4%和15. 4%。为此,进-一步对该混合物进行了分离纯化，为使各修饰度产物得到有效分离,选Lane 1. Protein markers; Lane 2. PEG-hirudin; Lane 3. Hirudin;择水蛭素与mPEG SPA摩尔比1:1的反应产物进Lane4 , 5. Peak1 and peak2; Lane6●7. Peak3; lane8，9. Peak4and peak5行分离纯化。Fig 3 SDS-PAGE of fractions isolated with anion-ex-change chromatography4500 600240002.3凝胶过滤层析3900因反应产物之间分子质量相差5 000 u,因此,12371 178692500尝试采用凝胶过滤方法分离。从图4可见,各组份2000之间达到了较好分离。各洗脱峰SDS-PAGE结果:1S00 .1000见图5中国煤化工别是PEG3-水蛭s00素、PEMHCNMH Gg,峰4是反应中5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000剩余的水蛭素,峰5在电泳中表明是非蛋白类成Fig 1 MALDI-TOF mass spectrum of PEGylated hirudin分,且无抑制凝血酶的活性,可能是反应中产生的304药物生物技术第11卷第5期琥珀酰亚胺等小分子。PEG1-水蛭素,但在较低盐浓度时, PEG3-水蛭素,PEG2-水蛭素和PEG1-水蛭素不能得到完全分离。这是因为,一-方面,不同修饰度水蛭素的电离常数的改变较小;另一方面,由于PEG连接位点的不同,连接相同数目PEG的水蛭素的同分异构体在1离子交换层析中的色谱行为不同(数据另文报道)，因而连接位点不同而形成的同分异构体是导致各组份间分离困难的重要原因之- _叫。 .20406080100120140160.作者采用凝胶过滤层析分离PEG-水蛭素,避Elution time(min)开同分异构体造成的困难,各组份得到了有效分Fig 4 Chromatograph of gel filtration of PEGylated hirur离,并且小批量制备了3批产品,分析了各组份的din生物活性,证明接1个和2个PEG分子不影响水6蛭素活性,而接3个PEG使其活性大大下降。其原因可能有两方面:一是接3个PEG后,对水蛭素活性有较大影响的赖氨酸被修饰,引起水蛭素活性下降。有研究表明,水蛭素47位赖氨酸(Lys47)对维持水蛭素稳定的空间构象具有重要意义[2]。其侧链氨基被PEG修饰后,可影响与其它氨基酸;的相互作用,水蛭素空间结构可能发生改变或不稳定导致活性下降;另-方面原因可能是多接1个PEG后造成PEG对水蛭素的空间屏蔽作用,使其Lanel. Protein markers; lane2. Hirudin; lane3. PEG hirudin; lane4活性区无法与凝血酶相互作用，表现为生物活性下~6. Fraction from peak3,2,1 respectively降。该分离纯化方法比较稳定,可以放大适应工业Fig5 SDS-PAGE of fractions isolated with gel filtration化生产的需求。同时,优化PEG对水蛭素的修饰2.4生 物活性测定反应条件,提高PEG1水蛭素和PEG2-水蛭素的生物活性测定结果见表1。转化率、降低PEG3-水蛭素的产率具有重要意义。Tab 1 The specific activity of hirudin and PEGylated hiru-参考文献[1] SchenkJ F, Glusa E, Radziwon P, et al . A recombinant hir-Fractions .Specific activity(ATU/mg hirudin)udin( IK HIRO2) in healthy volunteers. Effects on coagula-PEG3- hirudin5850tion parameters and bleeding time[J]. Haemostasis, 1996,26:PEG2- hirudin17908140.PEG1-hirudin17300_2] Zoldhelyi P, Webster MWI, Fuster V, et al. RecombinantHirudin17454hirudin in patients with chronic, stable coronary artery diae-ase. Safty, hl-life and efet on coagulation parameters[J].由表1可看出,当连接1个和2个PEG时,水Circulation, 1993,88:2015.蛭素的生物活性不受影响，而当接3个PEG时,其[3] Saier MG, Somack R, Wliliamns L D. Plasma cerne and活性大大下降。immunological properties of long-acting superoxide dismutaseprepared yusing 35000 to 120000 dalton by poly-ethylene gly-3讨论中国煤化工i.l1966377.用离子交换层析和凝胶过滤层析对PEG修饰[4]YHC N M H GI, et al. Prolongation ofthe serum half-life period of superoxide dismutase by poly的水蛭素进行分离纯化。虽然离子交换层析中,在(ethylene glycol) modification[J]. J Control Release , 1997,较高盐浓度时，可以得到较纯的PEG2-水蛭素和46:253. .于爱平等:聚乙二醇修饰水蛭素的分离纯化与活性分析305[5] Katre N V. Immunogenicity of recombinant IL-2 modified by9] Grie bach U, St rzebecher J, Markwardt F. Assay of hirudincovalent attachment of polyethylene glycol[J]. J Immunol,in plasma using a chromogenic thrombin substrate [J].1990, 144:209.Thromb Res,1985,37:347.[6] Veronese F M,Harris J M. Introduction and overview of pep-[10] Kurf rst M M. Detection and molecular weight determinationtide and protein pegylation[J]. Adv drug deliv reu,2002,54:of polyethylene glycol- modified hirudin by staining after sodi-453.um dodeyl sulatepolyacrylamide gel etroporeis[J]. A-[7] Veronese F M Peptide and protein PEGylation:a revicw ofnal biochem ,1992 ,200:244.problems and solutions[J]. Biomaterials, 2001 ,22:405.[11] Snider J, Nville C, Yuan L C,et al. Characterization of the[8] Bullock J, Chowdhury S, Severdia A, et al. Comparison ofheterogeneity of polyethylene glycol-mdified superoxide dis-results of various methods used to determine the extent ofmutase by chromatographic and electrophoretic techniquesmodification of methoxypolyethylene glycol 5000 modified[J]. J chromatography,1992,599:;141.bovine cupric zinc superoxide dismutase[J]. Anal Biochem,[12] Rydelt T ], Tulinsky A. Refined structure of the hirudin-1997 ,254:254.thrombin complex[J]. J Mol Biol , 1991,221:583.Isolation of PEGylated Hirudin and Analysis on It's ActivityYU Ai-ping, JIANG Zhong hua, ZHONG Gen-shen, DONG Chun-na, W∪Zu-ze(Institute of Radiation Medicine ,Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100850,China)Abstract Hirudin was modified by activated polyethylene glycol ( PEG). Matrix- assisted laser desorp-tion ionization time of flight mass spectrometry(MOLDI-TOF-MS) determination indicated that the at-tachment of PEG produced a heterogeneous mixture of hirudin that differed by 5 000 U. Ion exchangechromatography and gel filtration were applied to isolate the products. Purified products by gel filtrationwere obtained and the activity was analyzed. The activity of hirudin linked with 1~2 PEG chains keptintact but that of hirudin linked with 3 PEG decreased markedly.Key words Hirudin, Polyethylene glycol, Chemical modification, Isolation《中国药物滥用防治杂志》2005年征订启事《中国药物滥用防治杂志>是经国家科学技术部批准、由卫生部主管、中国药物滥用防治协会、宁波戒毒研究中心主办的我国在药物滥用防治领域进行报道和交流的学术性期刊,《中国药物滥用防治杂志》的出版发行,将为进一步推动我国药物滥用防治工作及对药物滥用的预防、宣传、教育发挥积极作用。该刊于1995年创刊,刊号为:CN11-3742/R,双月刊,大16开本,64页,国内外公开发行,邮发代号:82 -768。<中国药物滥用防治杂志>设有法规、论著、综述、专题讲座、专论述评、论坛、临床报道、案例报道、基层园地及其他等栏目。面向全国医疗卫生、公安、部队等戒毒机构,社会医学及健康教育研究、宣传单位,各级卫生行政管理机构及大中专医学院校。《中国药物滥用防治杂志>2005年全年订价48元。欢迎单位和个人在当地邮局或中国药物滥用防治杂志社订阅。邮局汇款:中国煤化工邮编:100061单位:中国药物滥用防治杂志社MYHCNMHG地址:北京市崇文区法华南里11号楼中国药物滥用防治杂志社电话:(010)67157648 61757647 传 真:(010)67157648